Тяжелый меромиозин
Cтраница 1
Тяжелый меромиозин элюируется с колонки одним пиком. Следует помнить, что все операции по выделению и очистке проводятся на холоде. Раствор фермента в бидистиллированной воде хранят в холодильнике и используют в течение 2 - 3 нед. [1]
Метод получения тяжелого меромиозина ( ТММ) основан на частичном протеолитическом расщеплении миозина под действием трипсина. Отделение тяжелого меромиозина от миозина и от фрагмента хвостовой части миозиновой молекулы ( легкого меромиозина) основано на его хорошей растворимости при низкой ионной силе, когда легкий меро-миозин и миозин выпадают в осадок. [2]
Сложную картину с большим числом полос наблюдают при электрофорезе препарата тяжелого меромиозина в присутствии додецилсульфата натрия. В этом случае представляет интерес сопоставить данные по электрофорезу препарата ТММ ( тяжелого меромиозина) в диссоциирующих и в недиссоциирующих условиях. Это свидетельствует о том, что, несмотря на наличие многочисленных внутренних разрывов в полипептидных цепях, возникших в результате протеолиза, фрагменты цепей держатся вместе за счет нековалентного взаимодействия. [3]
С помощью ферментативного гидролиза лапанном они приготовили из миозина ферментативно активный субфрагмент S-1 тяжелого меромиозина, этот субфрагмент затем тринитрофенилировали. На рис. 11.5 показана хроматография нативного и тринитрофенилиро-ванного тяжелого меромиозина S-1 в присутствии либо Mg2, либо ЭДТА на колонках с АТР-агарозой, ADP-агарозой и AMP - - P ( NH) P - агарозой. Видно что во всех случаях, за исключением колонок с АТР-агарозой, концентрация хлорида калия, необходимая для элюирования в присутствии Mg2 % 0 2 моль / л, а различия в поведении нативного и тринитрофенилированного производного тяжелого меромиозина S-1 незначительны. [4]
 |
Схема строения молекулы мио - часть Молекулы является зина - двойной суперспиралью. Об.| Схема агрегации молекул fl ( G - 3KTHH - АТФ. [5] |
Схема агрегации показана на рис. 5.10. Головки, выступающие из толстой нити, образованы фрагментами S-1 тяжелого меромиозина. [6]
По данным Сент-Дьердьи, под действием протеолитических ферментов ( трипсина) миозин расщепляется на два компонента: Н - меромиозин ( тяжелый меромиозин), с которым связана аденозинтрифосфатазная активность миозина, и L-меромиозин ( легкий меромиозин), лишенный этой активности. [7]
Тяжелый меромиозин получают перевариванием миозина трипсином при комнатной температуре. [8]
Метод получения тяжелого меромиозина ( ТММ) основан на частичном протеолитическом расщеплении миозина под действием трипсина. Отделение тяжелого меромиозина от миозина и от фрагмента хвостовой части миозиновой молекулы ( легкого меромиозина) основано на его хорошей растворимости при низкой ионной силе, когда легкий меро-миозин и миозин выпадают в осадок. [9]
С помощью ферментативного гидролиза лапанном они приготовили из миозина ферментативно активный субфрагмент S-1 тяжелого меромиозина, этот субфрагмент затем тринитрофенилировали. На рис. 11.5 показана хроматография нативного и тринитрофенилиро-ванного тяжелого меромиозина S-1 в присутствии либо Mg2, либо ЭДТА на колонках с АТР-агарозой, ADP-агарозой и AMP - - P ( NH) P - агарозой. Видно что во всех случаях, за исключением колонок с АТР-агарозой, концентрация хлорида калия, необходимая для элюирования в присутствии Mg2 % 0 2 моль / л, а различия в поведении нативного и тринитрофенилированного производного тяжелого меромиозина S-1 незначительны. [10]
Сложную картину с большим числом полос наблюдают при электрофорезе препарата тяжелого меромиозина в присутствии додецилсульфата натрия. В этом случае представляет интерес сопоставить данные по электрофорезу препарата ТММ ( тяжелого меромиозина) в диссоциирующих и в недиссоциирующих условиях. Это свидетельствует о том, что, несмотря на наличие многочисленных внутренних разрывов в полипептидных цепях, возникших в результате протеолиза, фрагменты цепей держатся вместе за счет нековалентного взаимодействия. [11]
 |
Влияние Mg2 на поведение тяжелого меромиозина S-1 ( / и трнппт. [12] |
Однако их присутствие не изменяет и даже слегка понижает ( особенно Са24 -) сродство к ADP - и AMP-P ( NH) P-агарозе. Двухвалентные катионы одновременно ускоряют расщепление связанной молекулы АТР как нативным, так и тринитрофенилированным тяжелым меромиозином S-1, что было показано главным образом для агарозы с присоединенными молекулами [ у - 32Р ] АТР. [13]
С помощью ферментативного гидролиза лапанном они приготовили из миозина ферментативно активный субфрагмент S-1 тяжелого меромиозина, этот субфрагмент затем тринитрофенилировали. На рис. 11.5 показана хроматография нативного и тринитрофенилиро-ванного тяжелого меромиозина S-1 в присутствии либо Mg2, либо ЭДТА на колонках с АТР-агарозой, ADP-агарозой и AMP - - P ( NH) P - агарозой. Видно что во всех случаях, за исключением колонок с АТР-агарозой, концентрация хлорида калия, необходимая для элюирования в присутствии Mg2 % 0 2 моль / л, а различия в поведении нативного и тринитрофенилированного производного тяжелого меромиозина S-1 незначительны. [14]
Наиболее простым способом очистки служит высаливание фермента сернокислым аммонием. При этом собирают фракцию, выпадающую между 40 - 60 % насыщения Следует, однако, соблюдать два условия: во-первых, использовать сернокислый аммоний, перекристаллизованный с ЭДТА, так как даже следовые количества ионов магния, прочно связываясь с ТММ, ингибируют активность, и, во-вторых, перед добавлением к раствору фермента раствора насыщенного сернокислого аммония необходимо проконтролировать рН последнего и в случае необходимости довести его до нейтрального или слабощелочного. Выпавший в осадок тяжелый меромиозин отделяют центрифугированием, растворяют в небольшом объеме ( 3 - 6 мл) бидистиллята и диализуют при 0 - 4 С в течение ночи против 1 л бидистиллированной воды, чтобы освободиться от сернокислого аммония. Внешний раствор несколько раз меняют и проводят контроль на присутствие в нем ионов SC42 - с помощью насыщенного раствора хлористого бария. В диализном мешочке может вновь выпасть осадок, который следует от-центрифугировать и отбросить. В надосадочной жидкости одним из общепринятых методов определяют содержание белка, которое обычно составляет 1 - 10 мг / мл. [15]
Страницы: 1 2