Cтраница 1
Меченые метаболиты отделяют друг от друга и по возможности от сопутствующих соединений, которые могут помешать последующей идентификации. В зависимости от природы метаболита и отделяемых примесей после очистки методом ТСХ может потребоваться дополнительная очистка с применением методов гель-фильтрации, ВЭЖХ или ГЖХ. [1]
В табл. 69 приведены доли метки 12 обнаруженных меченых метаболитов от общего количества метки, содержавшейся в меченых соединениях, найденных в гидролизованной моче крыс. [2]
Можно ожидать, что быстро растущие ткани будут поглощать больше меченых метаболитов, чем нормальная ткань, растущая медленно или находящаяся в устойчивом состоянии. Концентрация Р32 в ядрах опухоли [10] и лейкеми-ческих клетках [11], избирательное отложение Sr89 в остеогенной ткани [5, 6] и увеличенный захват I130 и I131 гиперпластической тиреоидной тканью [12] подтверждают это положение. [3]
Указанные вопросы нуждаются в экспериментальном исследовании и большую роль в их разрешении смогут сыграть опыты с мечеными метаболитами. [4]
Интенсивность метаболизма С14 - ацетилена в 15 раз превышала интенсивность метаболизма в случае этилена, причем г / 3 ацетилена превращалась в процессе дыхания в С02, и примерно 80 % всех меченых метаболитов плода были представлены летучими веществами. Далее по описанной методике проводили концентрирование бензола, из которого затем получали упомянутые выше производные. [5]
Распределение различных элементов в растениях и животных и динамические условия транспорта питательных веществ в живом организме-все это проблемы, для решения которых вполне приложим метод меченых атомов. Методика работы имеет здесь такой же характер, как и при изучении проницаемости. После экспозиции с меченым метаболитом различные части организма измеряются на содержание меченого материала. Это может быть сделано как на целом организме, так и с отдельными частями его после секции. Разработаны специальные методы для тех случаев, если требуется полностью сохранить организм интактным, как например при клинических исследованиях. Обсуждение этих методов будет дано в гл. [6]
Уже давно известно, что при распаде фенилаланина и тирозина в организме животных образуется ацетоуксусная кислота. Начало расшифровки этого превращения было положено исследованиями о некоторых врожденных пороках обмена веществ у человека ( см. гл. Выяснение промежуточных реакций этого процесса значительно продвинулось в последние годы в результате исследований с применением меченых метаболитов и различных ферментных препаратов. Экспериментальные данные о выделении гомогентизиновой кислоты у больных алкапто-нурией, о повышенном выделении гомогентизиновой кислоты после приема с пищей фенилаланина и тирозина [930], а также об образовании ацетоуксусной кислоты из гомогентизиновой кислоты в перфузируемой печени [931, 932] дали основание предполагать, что гомогентизиновая кислота играет роль промежуточного продукта в обмене ароматических аминокислот. Было установлено, что у нормальных животных гомогентизиновая кислота, подобно фенилаланину и тирозину, подвергается окислению с образованием, в числе других продуктов, ацетоуксусной кислоты. [7]
Метаболизм хлортиамида в организмах теплокровных протекает в соответствии со схемой, приведенной на стр. Среди продуктов, выделяемых из организма, хлортиамид и дихлобенил отсутствуют. После перорального введения 14С - хлортиамида крысам в моче были обнаружены после гидролиза под действием р-глюкуронидазы или соляной кислоты 12 различных меченых метаболитов, среди них упомянутые выше в качестве метаболитов дихлобенила продукты гидроксилирования - нитрилы 2 6-ди-хлор - 3-окси - и 2 6-дихлор - 4-оксибензойной кислоты. Те же 12 метаболитов, как и следовало ожидать, обнаружены в подвергнутой гидролизу моче крыс после введения 14С - дихлобенила. Из них идентифицированы соединения I-V. Среди остальных семи метаболитов имеется ароматическая кислота неизвестного состава и две серусодержащие аминокислоты, возможно соответствующие формуле VI. В негидролизованной моче крыс метаболиты находятся в связанном виде, например с глюкуроновой или серной кислотой. [8]
Изотопные эффекты при использовании 14С незначительны, а реакции, приводящие к потере метки, очень редки. Выпускается широкий набор меченных 14С соединений, пригодных для непосредственного применения или в качестве исходных веществ для синтеза. Однако синтез меченых соединений с достаточно высокой для использования в работах по биосинтезу удельной активностью часто требует особого искусства [104,105]; трудности связаны с необходимостью сведения к минимуму потерь при работе с небольшими количествами веществ и с обеспечением минимального разбавления. Для получения сложных меченых метаболитов и их последующего включения часто применяют биосинтетическое включение 14С из простого предшественника. Эта методика, однако, неизбежно приводит к двукратному разведению меченого соединения, и, соответственно, потери должны быть очень велики. Кроме того, всегда существует опасность, что меченные таким образом природные поликетиды будут легко подвергаться биологическому расщеплению с образованием значительных количеств специфически меченного ацетата. Методы обнаружения радиоактивности настолько чувствительны, что такого рода непрямое включение может быть ошибочно принято за непосредственное включение; необходим внутренний контроль, например, путем одновременного определения включения в какое-либо неродственное соединение типа жирной кислоты. По указанным причинам результаты таких исследований не должны содержать никаких неоднозначных данных, только тогда они будут в принципе приемлемы. [9]
Масштабы гибели клеток в пределах вилочковой железы характеризуют следующие данные. Около 20 % больших клеток гибнут на протяжении цикла со скоростью примерно 2 6 % в час. В то же время радиоактивность тимоцитов на протяжении 17 ч после однократного введения мышам 3Н - тимидина является постоянной, несмотря на потерю меченых бластов. Это свидетельствует в пользу того, что погибшие клетки служат источником меченых метаболитов, утилизируемых пролиферирующими клетками. [10]
Чанг с сотрудниками [53] нашли, что после инъекции ТЭФ, меченного по углероду, 50 % его выводится из организма самцов комнатной мухи за 5 часов нормальной деятельности мух в виде этилениминных метаболитов. Радиометрические и колориметрические определения показали, что остаточная радиоактивность в организме мух обусловлена ТЭФ или этиленимином, тогда как радиоактивность экскрементов не была связана с этиленимином. Обработанные самцы мух удерживали 72 часа до 9 % исходной радиоактивности и 5 % этиленимина. Было доказано, что самцы мух при спаривании переносят в тело самок примерно 1 % радиоактивности, но этот перенос осуществляется, по-видимому, не через сперму, так как радиоактивность была распределена во всем теле самок, а не концентрировалась в семеприемнике или на конце брюшка. По-видимому, ТЭФ или меченые метаболиты были соединены с какими-то небольшими растворимыми молекулами или были свободными в семенной жидкости и после переноса спермы в семепри-емник самки быстро диффундировали по всему телу. Реакции ТЭФ с низкомолекулярными соединениями весьма вероятны, поскольку Хедин и др. [110] установили, что более 85 % радиоактивности меченого ТЭФ было связано с низкомолеку-пярными соединениями в теле хлопкового долгоносика. [11]
Почему ЯМР является столь полезным методом. Это вызвано многими причинами, но главная из них в том4 что метод ЯМР позволяет устанавливать взаимосвязи между конкретными объектами. Высокая информативность, определяемая большим диапазоном химических сдвигов н интеисивностей сигналов, имеет по существу общий характер для остальных спектральных методов, в том числе для ИК-спектро-скопии. В этом отношении ЯМР ие имеет больших преимуществ. Его особая ценность обусловлена тонкой структурой спектра, возникающей за счет взаимодействия между ядрами, а также различными другими взаимодействиями, такими, как ядерный эффект Оверхаузера, зависящий от взаимного расположения ядер. Если мы хотим охарактеризовать структуру выделенного чистого соединения, оценить протон-протонные расстояния в белке или выделить сигнал меченого метаболита из сложной природной смеси, то должны обратиться к тем свойствам, которые основаны на взаимодействии одного ядра с другим. [12]