Cтраница 1
Нингидриновый метод применим не ко всем аминокислотам и не используется больше, по-видимому, с 1960 года. Предпринимались попытки [121] декарбоксилирования в присутствии N-бромсукцинимида ( БСИ), однако образующиеся нитрилы и альдегиды, содержащие на один углеродный атом меньше, имели различные количественные соотношения в зависимости от характера аминокислоты. [1]
Так, при помощи нингидринового метода, позволяющего определять наличие свободных аминокислот, было показано, что гидролиз фибрина кристаллическим пепсином сопровождается выделением некоторого количества свободных аминокислот. Доказано, что пепсин наиболее быстро расщепляет пептидные связи, образованные аминогруппами ароматических аминокислот, а также связи ала-ала и ала-сер и ряд других. [2]
В настоящее время широко распространен достаточно точный нингидриновый метод определения аминокислот при помощи хроматографического разделения на бумаге. Однако разделение некоторых аминокислот обычной хроматографией на бумаге требует большой затраты времени; например, для разделения основных аминокислот, необходимо минимум 4 - 5 суток. Применение электрофоретического разделения позволило сократить время разделения лизина, аргинина и ги-стидина до 3 часов и за счет этого сократить общее время, необходимое для количественного анализа этих аминокислот, с 5 - 6 дней до 6 - 7 часов. [3]
В каждой фракции определяют аминокислоты нингидриновым методом. Большинство аминокислот находится в первом пике, ароматические аминокислоты несколько задерживаются, триптофан выходит из колонки в последнем пике. [4]
Нами рагзработан метод, позвол. Предлагаемый нами метод является модификацией кислого нингидринового метода Л. П. Алексеенко и В. Н. Ореховича 73 /, пределяющих пролин при хроматографировании на крахмале. [5]
Недостатком метода является большая трудоемкость опытов и необходимость полного удаления примесей. Последнее обстоятельство представляет особенные трудности в случае нингидринового метода определения аминокислот, когда в растворе имеются примеси аммиака. Однако этих трудностей значительно меньше при определении других органических и неорганических веществ. [6]
При ряде заболеваний выделение аминокислот с мочой повышается. Этот кропотливый метод вытесняется в настоящее время нингидриновым методом. Для надежного определения в моче аминокислот их необходимо вытеснить из хелатных комплексов. Для этого к моче добавляют комплексен, обладающий более высоким сродством к катионам, чем аминокислоты. Освободившиеся аминокислоты реагируют с нингидрином. Определив на фотометре интенсивность возникшей окраски, находят содержание аминокислот в моче. [7]
Из химических методов особое значение имеет метод определения первичных аминогрупп путем превращения их азота в газообразное состояние ( метод Ван-Слайка) и нингидриновый метод. Так определяется суммарное количество аминокислот. Для отдельных групп аминокислот разработаны специфические методы. [8]
При создании аминокислотных анализаторов были использованы все достижения аминокислотного анализа. Хроматография аминокислот на ионитах по существу осталась без изменений; необходимо было только обеспечить подачу элюента с постоянной скоростью. Потребовалось также преобразовать нингидриновый метод детектирования в непрерывный процесс, что было достигнуто путем модификации двух хорошо известных методов. Несколько позднее для проведения анализа был использован автомат для серийных колориметрических анализов, созданный фирмой Technicon. [9]
Пепсин действует преимущественно на внутренние пептидные связи, довольно далеко расположенные от концов полипептидной цепи, так как среди продуктов пепти-ческого гидролиза белка находят значительное количество полипептидов. Однако под влиянием пепсина разрываются также и некоторые пептидные связи, находящиеся на конце полипептидной цепи. Структура боковых цепей или радикалов аминокислот, находящихся по соседству от пептидной связи, определяет ее. Представление о том, что гидролитический распад белка под влиянием пепсина не сопровождается появлением свободных аминокислот, в настоящее время должно быть отвергнуто. Так, при помощи нингидринового метода, позволяющего определять наличие свободных аминокислот, было показано, что гидролиз фибрина кристаллическим пепсином сопровождается выделением заметного количества свободных аминокислот. Доказано, что пепсин наиболее быстро расщепляет пептидные связи, образованные аминогруппами ароматических аминокислот, а также связи ала-ала и ала-сер и ряд других. [10]
Сгущение раствора прекращают ( через 10 - 15 мин), когда на стенках вращающейся колбы появляется сиропообразная лента. Полученный гид-ролизат сгущают досуха, и колбу на несколько часов помещают в вакуумный эксикатор над NaOH. В 1 - 2 мл исследуемого на колонке образца должна содержаться цистеиновая кислота в количестве, эквимолярном 0 1 - 0 2 мг цистина. NaOH анализируют нингидриновым методом. Типичная кривая элюирования показана на фиг. Интенсивность окрашивания, вызываемого ци-стеиновой кислотой, превышает, как правило, интенсивность окраски, развиваемой лейцином, в 1 01 раза; точную величину этого множителя следует определять для конкретных экспериментальных условий. [11]