Cтраница 2
Один из методов получения субмитохондриальных частиц ( СМЧ) основан на обработке предварительно выделенных интактных митохондрий ультразвуком. Полученные таким способом СМЧ представляют собой замкнутые везикулы, образованные внутренней мембраной митохондрий. Формирование везикул под действием ультразвука происходит таким образом, что обращенная в матрикс интактных митохондрий поверхность внутренней мембраны становится наружной, обращенной в окружающую среду поверхностью мембраны СМЧ. Такое изменение ориентации мембраны делает СМЧ весьма удобным, а иногда и единственно пригодным объектом для изучения механизма реакций, протекание которых в интактных митохондриях опосредовано ( и может контролироваться) трансмембранным переносом веществ. Препараты СМЧ широко используются, в частности, при изучении АТФ-синтетазного комплекса, активный центр которого в этом объекте экспонирован в окружающую среду и свободно доступен для субстратов и продуктов катализируемой им реакции. [16]
Неспецифический перенос протонов через мембрану слева направо анионом U - освобождает энергию в виде тепла и разобщает окисление и фосфорилирование. Гидролиз АТФ приводит к переносу двух Н справа налево и возникновению электрохимического потенциала. Таким образом, АТФазная активность интакт-ных митохондрий мала до тех пор, пока отсутствуют пути переноса Н слева направо. В интактных митохондриях их концентрация обычно достаточно велика, чтобы обеспечить высокую скорость гидролиза АТФ в присутствии разобщителя. [17]
Один из методов получения субмитохондриальных частиц ( СМЧ) основан на обработке предварительно выделенных интактных митохондрий ультразвуком. Полученные таким способом СМЧ представляют собой замкнутые везикулы, образованные внутренней мембраной митохондрий. Формирование везикул под действием ультразвука происходит таким образом, что обращенная в матрикс интактных митохондрий поверхность внутренней мембраны становится наружной, обращенной в окружающую среду поверхностью мембраны СМЧ. Такое изменение ориентации мембраны делает СМЧ весьма удобным, а иногда и единственно пригодным объектом для изучения механизма реакций, протекание которых в интактных митохондриях опосредовано ( и может контролироваться) трансмембранным переносом веществ. Препараты СМЧ широко используются, в частности, при изучении АТФ-синтетазного комплекса, активный центр которого в этом объекте экспонирован в окружающую среду и свободно доступен для субстратов и продуктов катализируемой им реакции. [18]
Установлено также, что восстановление дыхательной цепи СМЧ сукцинатом или НАД-Н изменяет анизотропию спектра ЭПР спиновой метки. Оказалось, что добавление АТФ к суспензии неэнергизованных СМЧ вызывает значительные изменения спектра ЭПР - АТФ улучшает растворимость гидрофобной метки в мембранах СМЧ. По-видимому, такое изменение определяется конформационными изменениями структуры мембраны. Сходное влияние АТФ наблюдается и в интактных митохондриях. ДНФ и олигомицин в концентрациях более 1 мкг на 1 мг белка ингибируют этот процесс. При малых концентрациях ( 0 1 - 0 2 мкг на 1 мг белка) олигомицин подобно аллостериче-ским активаторам усиливает индуцированные АТФ конформа-ционные переходы в СМЧ. [19]
Ясно, что если учесть еще присутствие двух подвижных переносчиков, KoQ и цитохрома с ( они почти полностью отделяются при выделении комплексов), то этого достаточно, для того чтобы полностью описать все окислительно-восстановительные реакции митохондриальной системы переноса электронов. Так, объединение комплекса I с комплексом III позволяет получить митохондриальную НАД-Н: цитохром с - оксидоредуктазу. Для того чтобы такая реконструированная цепь эффективно работала, необходимо все эти комплексы смешать друг с другом в стехиометрических соотношениях, взяв их в довольно высокой концентрации вместе с цитохромом с и коферментом Q. Последние два компонента представляют собой подвижные, жирорастворимые переносчики, способные связывать между собой различные процессы как в реконструированных системах, так и в целых электронпереносящих частицах ( ЭПЧ) или митохондриях. Кофермент Q благодаря своей длинной алифатической боковой цепи хорошо растворим в липидах, а цитохром с, который представляет собой водорастворимый белок, становится жирорастворимым, соединяясь с митохондриалышми фосфолипидами. Наиболее убедительные доказательства того, что реконструированная из четырех комплексов цепь переноса электронов точно воспроизводит цепь интактной митохондрии, были получены в опытах с использованием ингибиторов. [20]