Cтраница 2
Следует, однако, подчеркнуть, что методы оптического поглощения или дисперсии оптического вращения дают информацию о состоянии всей глобулы фермента в целом, в то время как метод ультразвуковой инактивации отражает конформационное состояние активного центра. В любом случае наличие целого ряда структурных переходов молекулы лизоцима и его активного центра при температурах выше 20 С показывает, что распространение выводов рентгеноструктурного анализа лизоцима, как и других методов структурного анализа фермента, на иные условия следует проводить с достаточной осторожностью. [16]
Полипептидная цепь, включая R-группы и атомы Н, показана красным цветом. Участок молекулы субстрата, обозначенный черными линиями, лежит в канале ( или щели) молекулы лизоцима и удерживается в этом положении специфическими водородными связями ( изображены ярко-красными линиями) между ферментом и субстратом. Молекула субстрата представляет собой полимер с чередующимися звеньями N-ацетилглюкозамина и N-аце-тилмурамовой кислоты, имеющих циклическую форму и связанных друг с другом гликозидными связями, обозначенными A-F ( гл. Место, в котором молекула субстрата разрывается, показано пунктирной линией. [17]
При присоединении этих ингибиторов к лизоциму образуются устойчивые комплексы, структура которых может быть исследована рентгеновскими методами. На основе таких исследований удалось установить конформационные изменения фермента, обусловленные связью с ингибитором, и сделать заключение о механизме ферментативного де ствия молекулы лизоцима. [18]
Исследование строения молекулы лизоцима показало что в ней имеется особое место - углубление, которое и является активным центром молекулы. Действие лизоцима селективное, он действует только на те вещества, которые по своему строению подходят к углублению в его молекуле - так же, как ключ к замку. Проводя реакцию с этими веществами - субстратами, попавшими в ее углубления, молекула лизоцима затем освобождается от них. [19]
Изменения в теплоемкости обнаружены при сольватации всех элементов поверхности белка, особенно неполярных групп. Как уже отмечалось, уровень гидратации, выше которого теплоемкость белка остается постоянной, определяет завершение процесса гидратации. Для лизоци-ма эта величина составляет 0 38 г воды / г белка, что эквивалентно 300 молекулам воды на одну молекулу лизоцима. В отличие от других термодинамических параметров изотерма сорбции не дает возможности определить - момент завершения процесса гидратации. При проведении измерений этим методом система не находится в равновесии, и скорость реакций, протекающих в системе, может оказывать влияние на показания прибора. [20]
Они установили, что молекула лизоцима представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 129 аминокислотных остатков 20 разных типов. Молекула свернута в глобулу с максимальным размером около 40 А. Нумерация остатков начинается от аминного конца. Всего в состав молекулы лизоцима входит 1950 атомов. [21]
Лизоцим действует на связи С-О, помеченные пунктирными линиями. Хитин ( поли-р - АГА) расщепляется лизоцимом по всем таким связям. N-Ацетилглюкозамин ( АГА) и его олигосахариды - хитобиоза ( АГА) 2, хитотриоза ( АГА) 3 и хитотетроза ( АГА) 4 - действуют как ингибиторы лизоцима. По данным рентгеноструктурно-го исследования [17] трисахарид связывается в правой части щели молекулы лизоцима. Отсюда следует, что в этой части молекулы и расположен активный центр. [22]
Йозефсон и Эдман [55, 56] описали обратимую инактивацию лизоцима и рибонуклеазы безводной муравьиной кислотой; они объясняли этот факт N. Так, например, хлоргидрат лизоцима был растворен в безводной муравьиной кислоте ( приготовленной высушиванием 98 % - ной муравьиной кислоты над борным ангидридом) и выдержан в течение 16 час при 25; в течение этого времени вся ферментативная активность исчезла. Теоретическое число связей, которые в этих условиях могут претерпевать превращения, определяется наличием в молекуле лизоцима 10 сериновых и 7 треониновых остатков; расход щелочи при рН 7 5 соответствует миграции у 11 остатков. По новейшим данным Иозефсона [57], освобождающиеся аминогруппы формилируются; однако в противовес этой трактовке данные, полученные Рабиновичем [58], Смилли и Нейратом [59], а также Нарита [60], свидетельствуют о том, что реагент просто формилирует гидроксильные группы, а медленное потребление модифицированным белком щелочи объясняется гидролизом формильных эфиров. То, что присоединение формильных групп несомненно имеет место при модифицировании белка, было показано в опытах с использованием меченной С14 муравьиной кислоты. На основании собственного опыта автор считает, что прирост аминного азота, определяемый по методу Ван-Слайка, не может служить достаточно надежным критерием ацильной миграции. Это было обнаружено в исследованиях [61 ] по модифицированию инсулина путем растворения в различных хлорангидридах, когда не было найдено удовлетворительного соответствия между результатами определения аминного азота, которые приближались к рассчитанным величинам, и выходами аминоспиртов после восстанов-ления модифицированного инсулина боргидридом лития. Для лучшего понимания свойств модифицированных белков, образующихся в безводной кислой среде, очевидно, требуются более точные кинетические данные. Все приводимые в литературе величины скорости обратной О М - ацильной миграции в белках, по-видимому, слишком малы. [23]
Механизм гидролиза, по-видимому, заключается в том, что протон от карбоксила Глу-35 присоединяется к гликозидному кислороду, связывающему звенья D и Е, разрывая гликозидную связь. Первый углеродный атом кольца D при разрыве гликозидной связи превращается в карбокатион. Этот карбокатион на какое-то время стабилизируется анионом остатка Асп-52. Затем к указанному карбокатиону присоединяется гидроксильный ион из воды, окончательно стабилизируя кольцо D, а протон ( из воды) заменяет Н, отданный остатком Глу-35. Освободившийся дисахарид ( звенья Е и F) покидает молекулу лизоцима, освобождая место для следующих звеньев. [24]
Разработаны химические методы определения величины полипептидных цепей белковой молекулы. Так, лизоцим, белок, содержащийся в слезах и яичном белке и обладающий свойством уничтожать бактерии, имеет, как было установлено при помощи ультрацентрифуги, молекулярный вес около 14 000 и состоит примерно из 125 аминокислотных остатков. Применение описанного метода позволило показать, что имеется лишь одна свободная а-аминогруппа, и на этом основании был сделан вывод, что данная молекула состоит из одной полипептидной цепи. Если эта полипептидная цепь была бы растянута, то ее длина составляла бы около 450 А. Однако, как установлено при помощи ультрацентрифуги, дифракцией рентгеновских лучей и другими методами исследования, молекула лизоцима по фо рме близка к шару с диаметром около 25 А. Отсюда следует, что полипептидная цепь не может быть вытянутой, а должна быть скрученной, ибо только тогда молекула приобретет сферическую форму. [25]
Эффективную антимикробную защиту осуществляют и такие компоненты молекулярной конституции, как ферменты типа лизоцима. Они синтезируются не только животными, но и растениями, грибами, бактериями и даже вирусами. Более того, микробные лизоцимы служат своим владельцам как для защиты, так и для нападения на другие организмы. Механизм защитного действия макромолекул лизоцима не очень сложен. Один из аминокислотных мономеров макромолекулы этого белка - глютаминовая кислота - притягивает к себе из оболочки микробной клетки атом кислорода, скрепляющий ацетилглюкозамин с N-ацетилнейраминовой ( сиаловой) кислотой, и связь последних нарушается. Образующийся при этом промежуточный продукт - ион карбоксония - удерживается аспарагиновой кислотой молекулы лизоцима до тех пор, пока глютаминовая кислота не заберет протон у молекулы воды. После этого образовавшийся гидроксил соединяется с ионом карбоксония. В итоге этих химических пертурбаций оболочка микробной клетки разрушается и клетка погибает. [26]
Чтобы сравнить конформацию в порошках при очень низких степенях гидратации ( 0 02) с конформациями при более высоких уровнях гидратации ( выше 0 2), были сняты спектры ЭПР образцов лизоцима, ковалентно меченных сукциними-дил-2 2 5 5-тетраметил - 3-пирролин - 1-оксил - 3-карбоксилатом. Материал содержал две спиновые метки на одну молекулу белка для того, чтобы спин-спиновое взаимодействие было достаточно сильным. Среднее расстояние между спиновыми центрами составляет 26 - 28 А. Поэтому вплоть до разрешения в 1 А никаких изменений конформации с изменением степени гидратации не обнаруживается. Это заключение справедливо исключительно для тех участков белковой молекулы, которые прореагировали со спиновой меткой, и сохраняется возможность изменений на расстоянии более 1 А в других частях молекулы. Однако авторы полагают, что такая возможность маловероятна из-за широкого распределения аминогрупп около поверхности молекулы лизоцима и вследствие кооперативной природы процесса изменения конформации. Теоретически возможно также, хотя и мало вероятно, что конформации, различающиеся при различных уровнях гидратации при 25 С, сводились бы к одной и той же при - 160 С. [27]