Cтраница 1
Рекомбинантный белок ( Recombinant protein) Белок, кодируемый клонированной рекомбинантной ДНК. [1]
Какие критерии использует FDA при вынесении мнения о возможности использования рекомбинантного белка в качестве пищевого продукта или пищевой добавки. [2]
Например, может увеличиться количество полисахаридов на поверхности клеток, что приведет к ухудшению условий их выделения и лизиса, а также затруднит очистку рекомбинантного белка. [3]
Периодическое добавление субстрата к растущей культуре рекомбинантных микроорганизмов продлевает экспоненциальную фазу и отсрочивает наступление стационарной фазы, во время которой инициируются клеточные ответы на стрессовые воздействия, происходит синтез протеиназ и другие изменения метаболизма, уменьшающие выход рекомбинантного белка. Для поддержания метаболизма клетки-хозяина количество добавляемого субстрата необходимо постоянно увеличивать. Чтобы обеспечить непрерывный синтез рекомбинантного белка и его стабильность, нужно тщательно контролировать процесс и добавлять субстрат ( источник углерода и азота вместе с микроэлементами) сразу, как только в этом возникнет необходмость. В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рекомбинантного белка при периодической ферментации с добавлением субстрата выход продукта может возрасти на 25 - 1000 % по сравнению с простой периодической ферментацией. [4]
Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. [5]
Так, попытались выяснить, способствует ли повышению выхода рекомбинантного белка суперэкспрессия такого природного фермента системы секреции, как дисульфидизомераза, которая обеспечивает правильную укладку белковой молекулы в процессе секреции. [6]
Периодическое добавление субстрата к растущей культуре рекомбинантных микроорганизмов продлевает экспоненциальную фазу и отсрочивает наступление стационарной фазы, во время которой инициируются клеточные ответы на стрессовые воздействия, происходит синтез протеиназ и другие изменения метаболизма, уменьшающие выход рекомбинантного белка. Для поддержания метаболизма клетки-хозяина количество добавляемого субстрата необходимо постоянно увеличивать. Чтобы обеспечить непрерывный синтез рекомбинантного белка и его стабильность, нужно тщательно контролировать процесс и добавлять субстрат ( источник углерода и азота вместе с микроэлементами) сразу, как только в этом возникнет необходмость. В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рекомбинантного белка при периодической ферментации с добавлением субстрата выход продукта может возрасти на 25 - 1000 % по сравнению с простой периодической ферментацией. [7]
Аффинную метку отщепляли с помощью протеолитического фермента ( протеиназы) и очищали рекомбинантный белок от нее и от протеиназы хроматографи-ческими методами. Если рекомбинантный белок не предполагается использовать в медицинских целях, можно и не отщеплять гексагистидиновую последовательность, поскольку обычно она не влияет на структуру и функцию белка. [8]
Аффинную метку отщепляли с помощью протеолитического фермента ( протеиназы) и очищали рекомбинантный белок от нее и от протеиназы хроматографи-ческими методами. Если рекомбинантный белок не предполагается использовать в медицинских целях, можно и не отщеплять гексагистидиновую последовательность, поскольку обычно она не влияет на структуру и функцию белка. [9]
Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффин-ной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу ( химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [10]
Один из них основывается на присоединении к клонированному гену - без нарушения рамки считывания - сегмента ДНК, кодирующего короткую аминокислотную последовательность, которая специфически связывается с каким-либо химическим элементом, соединением или макромолекулой. Такую конструкцию встраивают в экспрессирующий вектор между промотором и сайтом терминации транскрипции. Короткая аминокислотная последовательность в составе рекомбинантного белка, синтезируемого в хозяйской клетке, играет роль аффинной метки. [11]
Периодическое добавление субстрата к растущей культуре рекомбинантных микроорганизмов продлевает экспоненциальную фазу и отсрочивает наступление стационарной фазы, во время которой инициируются клеточные ответы на стрессовые воздействия, происходит синтез протеиназ и другие изменения метаболизма, уменьшающие выход рекомбинантного белка. Для поддержания метаболизма клетки-хозяина количество добавляемого субстрата необходимо постоянно увеличивать. Чтобы обеспечить непрерывный синтез рекомбинантного белка и его стабильность, нужно тщательно контролировать процесс и добавлять субстрат ( источник углерода и азота вместе с микроэлементами) сразу, как только в этом возникнет необходмость. В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рекомбинантного белка при периодической ферментации с добавлением субстрата выход продукта может возрасти на 25 - 1000 % по сравнению с простой периодической ферментацией. [12]
Было разработано несколько аффинных меток. Среди них - глутатионтрансфераза, белок, связывающий мальтозу, и короткие аминокислотные последовательности - антигенные детерминанты, которые связываются соответственно с глутатионом, мальтозой и специфическими антителами. Использовали и разные сайты расщепления, специфичные для тромбина, энтерокина-зы и других протеиназ. Аффинная метка и сайт расщепления могут находиться как на N -, так и на С-конце рекомбинантного белка и использоваться в прокариотических системах экспрессии, а также в системах экспрессии на основе клеток насекомых, млекопитающих или грибов. [13]