Cтраница 2
Были получены мутантеые ллазмиды, которые кодируют аномальный репрессор ади же имеют несовершенный механизм регуляции го образования. При 30 С репликация - идет - нормально, и на клетку образуется 1 - 2 плаз-мидные копии, а при 43 С репликация инициируется гораздо чаще, так что в клетке накапливается по нескольку сот плазмид. Небольшой сегмент R1, содержащий участок начала репликации и связанные с ними регулирующие элементы, был ис-шльзован для создания плазмид-йекторов, применяемых при клонировании разнообразных генов. Преимущество таких векторов заключается в том, что при повышенной температуре с их помощью можно получать множества копий клонируемого гена, а следовательно, и много белка, кодируемого этим геном. [16]
Изучению механизмов контроля репликации и числа копий: бактериальных плазмид посвящено множество работ. Было-обнаружено, что число копий плазмид примерно одинаково в клетках, размножающихся с разной скоростью. Из этого следует, что репликация плазмид как-то связана с ростом бактерий. Такая координация достигается при участии механизмов, контролирующих начало репликации. Если уж репликация началась, то она идет с относительно постоянной скоростью при любом темпе размножения бактерий. При высокой скорости размножения репликация индуцируется чаще в случае много-копийных плазм ид, чем малокопийных. [17]
Деление прокариотной клетки начинается, как правило, спустя некоторое время после завершения цикла репликации молекулы ДНК. Вероятно, репликация бактериальной хромосомы запускает какие-то процессы, ведущие к клеточному делению. Получены данные о том, что сигналом к клеточному делению служит начало репликации ДНК, ее завершение или репликация определенного локуса бактериальной хромосомы. Таким образом, в норме существует вполне определенная временная связь между репликацией хромосомы и делением бактериальной клетки. Воздействия различными химическими веществами и физическими факторами, приводящие к подавлению репликации ДНК, останавливают и клеточное деление. Однако при некоторых условиях связь между обоими процессами может быть нарушена, и клетки способны делиться в отсутствие синтеза ДНК. [18]
ДНК) состоит из двух компонентов: изучаемого полинуклеотидного фрагмента ( обычно структурного гена) и вектора. В последовательности иуклеоти-дов гена закодирована последовательность аминокислот белка. Однако структурные гены как таковые лишены регуля-торных геиетич. Функциональный компонент рекомбинаитной ДНК-вектор, т.е. специально сконструированная молекула, содержащая регуляторные участки, а именно: начало репликации ДНК, генетич. Большинство векторов получено на основе плазмнд ( небольших кольцевых молекул ДНК бактерий), фагов лямбда и М13, вирусов 8У40 и полиомы ( для животных клеток), плазмиды П из А § гоЪас1епшп ШтеГашем ( для клеток растений), двухмикронной плазмиды пекарских дрожжей. [19]
Полимеризация дочерней ДНК на матрице ДНК приводит к ее удвоению или репликации. Для реализации механизма репликации необходима матрица - расплетенная цепь ДНК, субстраты, участвующие в полимеризации ДНК, ферменты, катализирующие этот процесс, ионы Mg2, а также белковые факторы, обеспечивающие деспирализацию двухнитевой ДНК. У прокариот ДНК имеет форму кольца, причем в определенном ori - сайте origin - начало репликации) цепи расходятся и образуются две репликативных вилки, движущиеся в противоположных направлениях. У эукариот имеется большое число ori - сайтов, и репликация проходит одновременно на многих участках ДНК. В точках начала репликации отмечено большое количество АТ пар оснований, соединенных всего лишь двумя водородными связями, что способствует более легкому разрыву и расхождению цепей. [20]
Чтобы образовать молекулу активной РНК-репликазы, продукт S-цистрона фага комплексируется с тремя хозяйскими белками, выполняющими в нормальной клетке другие функции. Таким образом, полный активный фермент является белком с четвертичной структурой, обладающим четырьмя различными субъединицами, лишь одна из которых кодируется фаговой РНК. РНК-репликаза является РНК-зависимой РНК-полиме-разой, использующей исходную () цепь MS2 РНК сначала для образования комплементарной ( -) цепи, а затем для синтеза на ней многочисленных копий исходной () цепи. А-цистрон не может транслироваться до тех пор, пока не начнется репликация MS2 РНК. Однако в начале репликации () цепи MS2 РНК, когда цепь растет в направлении от 5 -конца к З - концу, пространственная структура 5 -концевого отрезка, содержащего инициирующий кодон А-цистрона, в течение какого-то времени еще не сформирована, и, по-видимому, именно этот момент используется для инициации трансляции в нормальных условиях. Так как в готовой вирусной частице содержится всего одна молекула А-белка на 180 молекул белка оболочки, то сравнительно короткого промежутка времени, в течение которого возможна инициация трансляции А-цистрона, оказывается достаточно для надлежащей продукции А-белка. Затем наращиваемая далее последовательность цепи MS2 РНК вовлекает инициирующий район А-цистрона в образование структуры, которая выключает его доступность для свободных инициирующих рибосом. [21]
Ключевое значение при конструировании рекДНК in vitro имеют ферменты - рестриктазы, рассекающие молекулу ДНК на фрагменты по строго определ. ДНК-лигазы, сшивающие фрагменты ДНК в единое целое. Рекомбинантная молекула ДНК имеет форму кольца, она содержит ген ( гены), составляющий объект генетич. Гены, подлежащие клонированию, могут быть получены в составе фрагментов путем механич. Но структурные гены, как правило, приходится либо синтезировать химико-биол. Структурные гены содержат только кодированную запись конечного продукта ( белка, РНК), полностью лишены регут ляторных участков и потому не способны функционировать ни в клетке хозяине, ни in vitro. Функциональные свойства рекДНК придает вектор, в к-ром присутствуют участки начала репликации, ( обеспечивают размножение рекДНК), генетич. Большая часть векторов получена из плазмид кишечной палочки и др. бактерий. Используют также векторы на основе фага лямбда, вирусов SV 40 и полиомы, дрожжей, Agrobacterium tume-faciens и др. При получении рекДНК образуется чаще всего неск. Поэтому обязательный этап составляет селекция и мол. Наиб, часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и др. бактерии, а также дрожжи ( Saccharomyces cerevi-siae), животные и растит, клетки. Систег ма вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину, его выбор зависит от видовой специфичности и целей исследователя. Существуют 3 пути селекции рекДНК: генетический ( по маркерам, с помощью изби-рат. [22]