Cтраница 2
При установлении структуры белка обычными методами все эти рефлексы должны быть измерены как для белка, так и для каждого изоморфного производного, что требует еще больших затрат времени. В результате возрастание затрат времени на эксперимент, а также трудности расчетного характера могут чрезмерно усложнить задачу установления труктуры белка с высоким разрешением. Для большинства кристаллических белков точность определения фаз ухудшается при достижении предельного разрешения 200 пм. К тому же интенсивность рентгеновских лучей мала и трудно точно ее измерить. На основании всего вышесказанного становится ясно, почему при рентгеноструктурном анализе кристаллических белковых молекул теоретический предел разрешения d - im практически никогда не достигается. Поскольку карты электронной плотности при различных уровнях разрешения позволяют обнаружить различные уровни организации структуры белка и поскольку влияние ошибок становится более существенным при уменьшении dmln, обычно при анализе структуры белка указывается лишь предельная величина dmin без оценки предела разрешения. [16]
Некоторые высокомолекулярные соединения обычно не получаются в виде волокон, например глобулярные белки, многие из которых могут быть получены в кристаллической форме. Аналитическое исследование состоит прежде всего в определении симметрии кристалла, размеров элементарной ячейки и затем пространственной группы. Такой анализ проведен для большого числа кристаллических белков. В случае глобулярных белков появляются трудности при попытках определения параметров атомов в молекуле. В то время как в небольшой молекуле число атомов может быть порядка десяти или двадцати, в молекуле глобулярного белка имеется тысяча и более атомов. Это означает, что вместо нахождения десяти или двадцати членов ряда Фурье потребуется иметь дело с тысячью и более членов, для каждого из которых должна быть определена его фаза. Можно провести расчеты по Паттерсону, при которых определения фаз не требуется; такие расчеты могут дать некоторые ценные сведения ( Kendrew, Perutz, 1949), но до настоящего времени не удалось провести ни одного определения полной структуры кристаллического белка. [17]
По причинам, указываемым ниже, обычно невозможно получить из рентгенографических данных непосредственно выводы о расположении атомов. За последние годы, правда, были разработаны для этого прямые методы, однако они трудоемки, требуют значительных вычислений и эффективны только при особых, специфических для них условиях. Один из этих методов, пригодный для изучения кристаллических белков, будет описан ниже. [18]
Новые успехи применения рентгеноструктурного анализа в расшифровке строения глобулярных белков были неразрывно связаны с его дальнейшим методическим усовершенствованием. Этот прием позволил разработать и усовершенствовать так называемый метод изоморфного замещения, который дал исследователям принципиальную возможность однозначно определять белковые структуры. В продолжение 1953 - 1960 гг. метод был использован для изучения многих кристаллических белков, главным образом гемоглобина, миоглобина, инсулина, рибонук-леазы и лизоцима. [19]
О в настоящее время определено с высокой ] точностью ( 2 94 А), тогда как углы, в вершинах которых находятся атомы N и О, известны гораздо хуже. Поэтому вопрос о линейности И-связи до сих пор остается открытым. Значения длины связей и углов, найденные для пептидной группы, использованы при построении спиральных структур, которые согласуются с большинством известных свойств основной цепи кристаллических белков и ДНК и в которых отчетливо видна важная роль Н - связи. Относительно боковых цепей в этих молекулах, а также в глобулярных белках делались лишь умозрительные заключения, но и в них Н - связи отводится важная роль. [20]
Было ясно показано и неоднократно подтверждено, что кристалличность не является критерием гомогенности; однако следует отметить, что кристаллизация представляет собой весьма важный препаративный метод при получении белков. Кристаллизация редко осуществляется, если смесь природных белков не содержит одного из компонентов в большом избытке или если эта смесь не подвергалась предварительной очистке. Кристаллизация сама по себе часто сопровождается значительной очисткой препарата, и нередко с помощью многократной кристаллизации можно удалить следы других белков. Кристаллические белки относительно удобны в обращении. Наконец, в связи с тем, что до настоящего времени ни один денатурированный белок не был получен в кристаллическом состоянии, кристаллизуемость белкового препарата дает уверенность в том, что основная масса его находится в нативном состоянии. [21]
Это серьезно ограничивает выбор лабораторных методов, с помощью которых химик может отделить один белок от другого. Тщательно регулируя такие факторы, как концентрация солей или спирта, кислотность или температура, можно добиться достаточно избирательного осаждения данного белка. В настоящее время часто удается изолировать один из десятков и даже сотен белков, присутствующих в тканевом экстракте. Хотя кристаллическое состояние само по себе не является достаточным доказательством чистоты белка, все же получение кристаллических белков впервые дало в руки биохимика воспроизводимый материал для изучения химической природы этих веществ. [22]
Грэм допускал, что только такие вещества, как клей, крахмал и каучук, образуют растворы, которые не проходят через мембрану. Эти вещества, которые к тому же не кристаллизуются, были названы коллоидами. Напротив, другие вещества, например соли, сахар и мочевина, легко проходят через мембрану и образуют кристаллы. Однако позже было установлено, что частицы некоторых дисперсных коллоидов, например золота, дают дебаеграммы, характерные для кристаллов. Некоторые кристаллические белки также образуют коллоидные дисперсии. Следовательно, способность кристаллизоваться не исключает способности образовывать коллоидные дисперсии. Итак, способность образовывать коллоидные дисперсии не является преимуществом названных веществ, как считалось в более старой теории. [23]
При анализе структуры малых молекул первичную карту электронной плотности получают при помощи прямых методов определения структуры или, например, методом Паттерсона, устанавливая положение нескольких наиболее тяжелых атомов в молекуле. Такая первичная карта Фурье обычно недостаточно ясна и может указывать максимумы электронной плотности только для некоторых атомов в молекуле. Положение этих атомов определяется при интерпретации первичной карты и используется для расчета набора фаз. Этот набор затем применяется для расчета карты электронной плотности с помощью наблюдаемых структурных амплитуд, в результате чего уточняются положения других атомов. Вклад этих атомов может быть затем использован для расчета улучшенного набора фаз, что приводит к более совершенной карте электронной плотности. Подобная процедура последовательно повторяется до тех пор, пока не будут определены все атомные параметры. Для уточнения фаз и расчета карт электронной плотности могут быть использованы альтернативные циклы. Поскольку в случае малых молекул число экспериментально наблюдаемых параметров ( структурных амплитуд) велико по сравнению с числом переменных параметров, структура малых молекул определяется с высокой точностью. Поскольку каждый атом должен быть охарактеризован тремя параметрами, указывающими местоположение, и, как правило, шестью параметрами, определяющими его тепловые колебания, число независимо наблюдаемых рефлексов рентгеновских лучей обычно ненамного превосходит число переменных параметров. Кроме того, для уточнения кристаллографических параметров и согласования их с опытными данными методом наименьших квадратов необходимо гораздо большее число наблюдаемых структурных амплитуд. Более существенным оказывается, однако, то, что синтезы Паттерсона в случае нативных кристаллических белков не поддаются интерпретации, поскольку в элементарной ячейке содержится большое число атомов и прямые методы определения структуры для больших молекул недостаточно развиты. Следовательно, эти методы не могут быть использованы при определении фаз в случае кристаллических белков. [24]
При анализе структуры малых молекул первичную карту электронной плотности получают при помощи прямых методов определения структуры или, например, методом Паттерсона, устанавливая положение нескольких наиболее тяжелых атомов в молекуле. Такая первичная карта Фурье обычно недостаточно ясна и может указывать максимумы электронной плотности только для некоторых атомов в молекуле. Положение этих атомов определяется при интерпретации первичной карты и используется для расчета набора фаз. Этот набор затем применяется для расчета карты электронной плотности с помощью наблюдаемых структурных амплитуд, в результате чего уточняются положения других атомов. Вклад этих атомов может быть затем использован для расчета улучшенного набора фаз, что приводит к более совершенной карте электронной плотности. Подобная процедура последовательно повторяется до тех пор, пока не будут определены все атомные параметры. Для уточнения фаз и расчета карт электронной плотности могут быть использованы альтернативные циклы. Поскольку в случае малых молекул число экспериментально наблюдаемых параметров ( структурных амплитуд) велико по сравнению с числом переменных параметров, структура малых молекул определяется с высокой точностью. Поскольку каждый атом должен быть охарактеризован тремя параметрами, указывающими местоположение, и, как правило, шестью параметрами, определяющими его тепловые колебания, число независимо наблюдаемых рефлексов рентгеновских лучей обычно ненамного превосходит число переменных параметров. Кроме того, для уточнения кристаллографических параметров и согласования их с опытными данными методом наименьших квадратов необходимо гораздо большее число наблюдаемых структурных амплитуд. Более существенным оказывается, однако, то, что синтезы Паттерсона в случае нативных кристаллических белков не поддаются интерпретации, поскольку в элементарной ячейке содержится большое число атомов и прямые методы определения структуры для больших молекул недостаточно развиты. Следовательно, эти методы не могут быть использованы при определении фаз в случае кристаллических белков. [25]