Cтраница 3
Низшие состояния окисления должны стабилизироваться лигандами, обладающими некоторыми и-акцеп-торными свойствами. По данным, полученным методом ЭПР, к таким биологически существенным лигандам могут относиться сульф-гидрильные группы. На основании этих данных обычно принимают, что в ходе каталитического акта в реакциях, катализируемых ксантиноксидазой и нитратредуктазой, происходят переходы между состояниями Mo ( VI) и Mo ( V) в реакциях переноса электрона. Имеются данные [22], что Mo ( IV) участвует в некаталитической стадии восстановления в процессе работы ксантиноксидазы. [31]
Наряду с коферментами существенную роль в формировании активных ферментов играют железо, медь, магний, марганец, кальций, цинк и др. Металлы могут выступать в качестве коферментов, а также активаторов ферментативной активности. Так, дефицит молибдена в пище животных проявляется в падении активности фермента ксантиноксида-зы. Дефицит этого же микроэлемента в питательной среде является причиной резкой инактивации нитратредуктазы у гриба Neurospora crassa. Для однозначного ответа на вопрос, является ли металл активатором или неотъемлемой частью зрелого фермента, необходимо получить последний в высокоочищен-ном или гомогенном состоянии. Если металл при диализе не отделяется от фермента, а более жесткое его удаление приводит к полному подавлению каталитической активности, значит, это истинный металлофермент. Металл в этом комплексе прочно связан с белком посредством множественных координационных связей. [32]
Известно, что во время очистки происходит обогащение молибденом нитратредуктазной фракции. Это служит доказательством того, что молибден входит в состав данного фермента. Количество молибдена на единицу белка возрастает пропорционально увеличению удельной активности фермента. Еще одно и притом более прямое доказательство связи молибдена с нитратредуктазой состоит в том, что этот фермент можно инактивировать путем диализа против цианида ( эта обработка часто используется для удаления прочно связанных с белком ионов металлов), причем неактивный препарат нитратредуктазы, не содержащий ионов металла, специфически реактивируется добавлением молибдена. Участие молибдена в цепи переноса электронов так, как это показано выше [ уравнение ( 20) ], доказывается в опытах, в которых восстановленный неферментативным путем молибден с валентностями 5 и 3 действует в качестве донора водорода вместо НАДФ-Н2. Однако интерпретация результатов этих экспериментов осложняется в связи с возможностью неферментативного восстановления нитрата фос-форномолибденовыми и кремниймолибденовыми комплексами. Тем не менее в настоящее время твердо установлено, что компонентами нитратредуктазной системы являются НАДФ-Н2, ФАД, Мо и апофермент. Менее определенна последовательность функционирования этих компонентов в восстановлении нитратов, однако представленная выше схема может служить в данном случае достаточно хорошей рабочей гипотезой. [33]
В большинстве случаев конечным акцептором электронов служит 02, который не может быть заменен никаким другим акцептором. Рост отдельных штаммов возможен в микроаэробных условиях. Некоторые тионовые бактерии являются факультативными аэробами; они могут использовать в качестве конечного акцептора электронов не только 02, но и нитраты, восстанавливая их до N2 или только до нитрита. В анаэробных условиях использование нитратов в качестве конечного акцептора электронов индуцирует синтез диссимиляционной нитратредуктазы, осуществляющей перенос электронов дыхательной цепи на нитраты. [34]
Полная классификация всех известных в настоящее время нитратредуктаз, основанная на механизме их действия, пока не осуществима. Известные редуктазы, выделенные из множества разнообразных организмов, различаются по растворимости, по типу используемого донора водорода, по конечному продукту ( нитрит или аммиак) и по потребности в тех или иных кофакторах. Вполне вероятно, что число этих различий уменьшится после того, как удастся получить более очищенные препараты этих ферментов. Не исключено, что полученные в разных лабораториях препараты содержат фрагменты системы переноса электронов, сопряженные с нитратредуктазой. Следовательно, сложный состав полученных препаратов должен определять количество и характер используемых до норов электронов, а также количество и характер необходимых кофакторов. [35]
При использовании этой очищенной растворимой ферментной системы можно показать, что цитохром frj способен к самоокислению, и в присутствии кислорода не происходит никакого восстановления нитрата. В отсутствие кислорода нитрат восстанавливается в нитрит. В аэробных же условиях эта система будет функционировать как цитохромоксидаза. Это означает, что при указанных условиях должен функционировать цитохром, не способный к самоокислению. Возможно, что с одной и той же нитратредуктазой сопряжены оба цитохрома. Функционирует ли данная редуктаза по аэробному или по анаэробному ассимиляционным путям, будет зависеть от того, принимает ли участие в этом процессе самоокисляющийся или несамоокисляющийся цитохром. [36]
В работах [79, 80] были установлены некоторые важные взаимосвязи между субъединицами нитратредуктазы JV. Реставрация in vitro активности НАДФН-нитратредуктазы приводит к изменению природы активности цитохром с-редуктазы, указывая на то, что фермент образуется путем ассоциации субъединиц. Чтобы объяснить способность ферментов из различных источников отдавать молибденсодержащие субъединицы, необходимые для образования in vitro ассимиляционной нитратредуктазы, Насон предположил, что молибден составляет часть субъединиц сравнительно низкого молекулярного веса, которые можно рассматривать как кофактор и которые входят в состав большинства, если не всех молибденсодержащих ферментов. Кислотная обработка фермента требуется для освобождения этого кофактора, который затем может связываться с субъединицами мутанта nit - 1 с образованием полного фермента нитратредуктазы. Экстракты Neurospora могут служить источником молибденсодержащих субьединиц и без предварительного подкисления. [37]
Для обеспечения НАДФН-нитратредуктазной диссимиляции требуются железо и молибден. В этом отношении фермент из указанного источника аналогичен нитратредуктазе из денитрифицирующих бактерий. Однако большинство очищенных ферментов не меняли свою активность в присутствии хелатирующих железо реагентов, содержали тем меньше железа, чем хуже были очищены препараты, и в них не были обнаружены цитохромы или флавин. НАДФН не является эффективным донором электронов для очищенного фермента, тогда как бензилвиологен ( N, М - дибензил-4 4 -ди-пиридил) может выступать в этом качестве. Эти наблюдения согласуются с гипотезой, согласно которой НАДФН-нитратредуктазная активность обеспечивается двумя ферментами [78]: один из них - ФАД-зависимая НАДФН-диафораза, которая может использовать в качестве акцепторов электронов многие вещества, в том числе окисленный цитохром с; другой фермент - это собственно концевая нитратредуктаза, молибденсодержащий белок, использующий в качестве доноров электронов восстановленные флавин-нуклеотиды. [38]
Живые организмы сильно различаются между собой по своей способности синтезировать аминокислотные предшественники этих типов молекул в отношении источников азота, которые они могут использовать для целей биосинтеза. Высшие животные не способны к биосинтезу ряда аминокислот ( их называют незаменимыми) и должны получать эти аминокислоты извне. Кроме того, они не могут использовать наиболее широко распространенные формы природного неорганического азота, а именно нитраты, содержащиеся в почве, и атмосферный азот, для синтеза даже и таких аминокислот, которые не относятся к незаменимым. Однако растения и многие микроорганизмы обладают более широкими возможностями: они могут синтезировать все содержащиеся в белках аминокислоты, исходя из нитратов или аммиака. Биологическая ассимиляция нитрата в аммиак происходит в две основные стадии: 1) восстановление нитрата до нитрита и 2) восстановление нитрита до аммиака. Первая из этих реакций катализируется молибденсодержащим ферментом нитратредуктазой. Аммиак образуется также при фиксации молекулярного азота бактериями. Эта реакция осуществляется свободно обитающими в почве бактериями, например Clostridium pasteuranium, а также, что еще более существенно, некоторыми почвенными бактериями, живущими в клубеньках корней ряда овощных культур. К таким бактериям относятся, например, Rhizobium. Оба эти процесса фиксации катализирует другой молибденсодержащий фермент - нитрогеназа. [39]
Еще в XIX веке стало известно, что биохимическая активность бактерий меняется при добавлении в среду способных сбраживаться углеводов. Так, гнилостные бактерии, растущие на мясном бульоне, в присутствии сахарозы переставали продуцировать индол. Гейл показали, что подобным же образом репрессируются дезаминазы некоторых других аминокислот, а Дж. Моно обнаружил, что глюкоза предотвращает синтез ферментов, необходимых для расщепления других Сахаров. Впоследствии много аналогичных примеров было обнаружено не только у бактерий, но и у дрожжей, и это явление получило название глюкоз-ного эффекта. Магасаник указали, что все ферменты, репрессируемые глюкозой, имеют одно общее свойство, а именно образующиеся при их действии метаболиты, необходимые для роста бактерий, могут быть гораздо быстрее получены из глюкозы. Например, дезаминирование аминокислот приводит к образованию кетокислот, которые также образуются в ходе гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и других аналогичных процессов. Наоборот, конечные продукты ферментов, нечувствительных к глюкозе, не образуются из глюкозы. Так, ни тетратионатредук - таза, ни нитратредуктаза не репрессируются глюкозой, и продукты их действия не образуются из глюкозы. Однако глюкоза служит не просто добавочным источником необходимых метаболитов. [40]