Геномная библиотека

Cтраница 1

Геномная библиотека, банк ( библиотека) генов ( Genome library) Набор клонированных фрагментов ДНК, в совокупности составляющих индивидуальный ( групповой, видовой) геном. Если речь идет о крупном геноме ( млекопитающие), то получают хромосомоспецифич-ные библиотеки. [1]

Скрининг кДНК - или геномных библиотек с помощью гибридизации с гетерологичным зондом не очень эффективен при идентификации целлю-лазных генов, поскольку их нуклеотидные последовательности довольно сильно различаются у разных организмов. Поэтому нужны новые подходы для выделения мРНК целлюлолитических ферментов из грибов или растений. К сожалению, эти мРНК составляют лишь небольшую часть суммарной мРНК, поэтому приходится обогащать библиотеки этими мРНК или кДНК и элиминировать кДНК - клоны, не несущие последовательности-мишени. [2]

При построении физических карт тех или иных районов хромосом или целых хромосом из геномных библиотек, содержащих крупные вставки ( YAC -, ВАС - или РАС-библиотек), наиболее приемлем метод картирования, основанный на использовании STS. [3]

Рекомбинантные белки, синтезируемые в системах экспрессии S. cerevisiae. HIV-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа. [4]

С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транс-криптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. При встраивании чужеродной ДНК в YAC может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YAC-векторы несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. [5]

Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмидами: в них можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания геномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг. [6]

Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку ( например, нитроцеллюлозный или найлоно-вый фильр так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чашке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК ( положительный гибридизационный сигнал, отбирают из них материал и культивируют. [7]

Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга геномной библиотеки необходимо определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген. [8]

В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. [9]

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. [10]

Обычно бывает очень трудно обнаружить кДНК, соответствующую мРНК, которая присутствует в данной ткани в маленькой концентрации. С помощью RACE-метода можно быстро получить кДНК, отвечающие концевым участкам этой мРНК, и при необходимости использовать их в качестве зондов для скрининга кДНК - и геномных библиотек. Кроме того, поскольку неполноразмерные 3 -концевые фрагменты кДНК значительно преобладают над полноразмерными, 5 RACE может восполнить недостающие 5 -концевые сегменты. [11]

Позиционное картирование. Идентификация гена, продукт которого неизвестен, с помощью хромосомного картирования и зондов, специфичных в отношении тесно сцепленных маркеров. [12]

Из контига, охватывающего район хромосомы, содержащий ген заболевания, выбирают геномные клоны, которые включают фланкирующие маркеры и заключенный между ними участок ДНК. Если такой контиг отсутствует, то с помощью зондов, специфичных в отношении тесно сцепленных маркерных сайтов, проводят скрининг библиотек геномных ДНК для выявления клонов, происходящих из того района, который содержит искомый ген. После создания геномных библиотек, содержащих крупные фрагменты ДНК человека, и контигов эти стратегии утратили свою актуальность. [13]

Длина синтезированных in vitro молекул обычно составляет 20 - 30 нуклеотидов и редко превышает 100 нук-леотидов. Для получения двухцепочечных молекул комплементарные цепи синтезируют по отдельности и затем проводят отжиг. Полученную таким способом ДНК используют в качестве зондов для скрининга геномных библиотек; в качестве линкеров и адаптеров при клонировании генов; для мутагенеза in vitro; для конструирования генов с целью последующего клонирования. [14]

В случае Х - сцепленного заболевания его ген расположен на Х - хромосоме, для ау-тосомных болезней хромосомная локализация гена неизвестна. Чтобы картировать ген в специфическом районе хромосомы, можно идентифицировать сцепленные с ним маркерные сайты, используя для этого метод ПДРФ и STRP-картирование. Для оценки сцепления между маркерным сайтом и геном заболевания используют метод максимального правдоподобия. Физические карты хромосом ( контиги) строят на основе геномных библиотек, содержащих крупные ( YAC, ВАС и РАС) и небольшие ( космиды, Р1 и Я) фрагменты ДНК человека, используя STS-картирование или другие подходы, в тгом числе геномную дактилоскопию. Транскрипционные карты состоят из участков кДНК и маркерных экспрессируемых последовательностей ( EST), расположенных вдоль хромосомы. Построение генетических, физических и транскрипционных карт облегчает идентификацию и характеристику генов заболеваний. [15]

Страницы: 1