Элюирующий объем
Cтраница 2
Количество образца, загружаемого в гелевую колонку, влияет на степень разрешения компонентов этого образца тремя взаимосвязанными способами, как и при других методах фракционирования на колонке. Объем самого образца прибавляется к элюирующему объему колонки, характерному для каждого компонента образца. Далее концентрация каждого компонента влияет на ширину пика элюирования этого компонента. Это влияние становится более выраженным при увеличении размера молекул. Другое ограничение на концентрацию образца накладывает вязкость полимерного раствора - это так называемое вязкое контактирование. Чем более резко меняется вязкость на задней границе зоны образца, тем менее устойчивой становится эта граница. Разрежение, создаваемое вязким течением образца, вынуждает далее растворитель просачиваться через некоторые слабые точки в колонке, при этом распределение скоростей в потоке жидкости становится весьма неоднородным до тех пор, пока не произойдет значительного уширения границы. В работе, посвященной фракционированию гемоглобина и соли на высокомолекулярных декстранах, Флодин [1] показал, что удовлетворительное разделение происходит при вязкостях ниже 4 сантипуаз. Если вязкости превышали указанный предел, разделение нарушалось, и при вязкости 11 8 сантипуаз профиль зоны сильно искажался и зона расширялась. [16]
Согласно данным Пората [12], увеличение ионной силы от 0 01 до 0 2 незначительно влияет на величины элюирующих объемов аминокислот и белков при использовании колонок с сефадексом. Однако 0 5 М Na резко уменьшает величину элюирующего объема лизоцима. При более высоких ионных силах может наблюдаться денатурация и влияние на результаты фракционирования ассоциации или диссоциации молекул растворенного вещества. Средние значения ионной силы и рН не оказывают заметного влияния на размер пор гелей. [17]
Практически найдено, что не вся вода, заключенная в частицах геля, доступна для диффузии низкомолекулярных растворенных веществ; например, для D-ГЛЮКОЗЫ на сефадексе G-25 константа Kd равна - - 0 7 - 0 8 вместо теоретической единицы. С другой стороны, адсорбция веществ на колонках увеличивает элюирующий объем. На заряженные молекулы влияет ионная сила и рН элтоирующего растворителя. [18]
Рассмотренный выше механизм гель-проникающей хроматографии, по-видимому, полностью подтверждается экспериментом. В большинстве случаев изменение скорости потока не влияет на элюирующий объем, что свидетельствует о весьма близком подходе системы к равновесным условиям. Следует также отметить, что нарисованная выше картина - весьма грубое приближение к действительности. На рис. 5 - 1 указаны молекулы растворенного вещества, которые, обладая весьма малыми размерами, могут диффундировать через все поры матрицы и даже в местах сужения пор. В то же время среди молекул растворенного вещества имеются такие молекулы, большие размеры которых позволяют им проникать лишь в поры определенных размеров, находящиеся только на внешней оболочке гранул геля. Однако должны существовать молекулы с промежуточными размерами, которые могут проходить через узкие места в порах, хотя с гораздо меньшей скоростью вследствие взаимодействия со стенками каналов. Крейг [1986] убедительно показал, что скорости прохождения молекул растворенных веществ в процессе диффузии через мембраны, по обе стороны которых концентрации этих молекул различны, не слишком различаются, если поры мембран значительно больше, чем размеры диффундирующих молекул. Однако скорости диффузии оказываются чувствительной мерой молекулярных размеров для тех молекул, размеры которых лишь немногим меньше диаметра пор. Очевидно, по своей природе процессы дифференциальной диффузии и гель-проникающей хроматографии близки друг к другу. [19]
В таких случаях колонку следует прокалибровать по веществам с известными молекулярными весами. Когда установлена калибровочная кривая для определенных типов молекул, по величинам элюирующего объема можно найти молекулярные веса неизвестных образцов, имеющих сходную с использованными для калибровки соединениями форму и структуру молекул. По сравнению с методом ультрацентрифугирования, применяемым для определений подобного рода, метод ГПХ более удобен и может быть применен при гораздо меньших концентрациях вещества, что позволяет проводить экстраполяцию на бесконечное разбавление более точно или даже совсем избежать такой экстраполяции. Метод ГПХ можно также легко автоматизировать. Полное распределение по молекулярным весам обычного синтетического полимера можно получить в течение 2 - - 5 час, даже если исследователь не имеет определенных навыков. [20]
 |
Влияние природы элюента и его температуры на факторы разделения а редкоземельных и траисплутоииевых элементов при их разделении на смоле Dowex 50. [21] |
При использовании молочной кислоты в качестве элюирующего агента ее растворы поражаются микроорганизмами или плесенью, что изменяет их состав. Кроме того, вследствие частичной димеризации молочной кислоты в растворе наблюдается плохая воспроизводимость элюирующих объемов индивидуальных элементов. [22]
Поэтому, чтобы не снизить эффективности фракционирования, следует выбрать такой гель, у которого полный внутренний объем как раз соответствовал бы диапазону размеров разделяемых молекул. Сказанное иллюстрируется рис. 5 - 3 ( кривая 1), где представлены зависимости логарифма молекулярного веса от величины элюирующего объема. В идеальных условиях такие зависимости описываются прямыми линиями во всей области изменения молекулярных весов. [23]
Концентрацию полимера в растворе, вытекающем из колонки, определяют спектроскопически, рефрактометрически или посредством осаждения растворенного полимера. Для установления связи между элюирующим объемом и молекулярной массой, зависящей от природы полимера, характеристик геля и многих других факторов, проводят калибровку колонки по образцам полимера с точно известными молекулярными массами. Зависимость логарифма молекулярной массы от элюирующего объема ( как правило, почти линейная) служит для калибровочной кривой при исследовании молекулярно-массовых распределений. [24]
Довольно часто проводят определения молекулярных весов отобранных фракций и тем самым осуществляют калибровку колонки для данного растворенного вещества. Иногда бывает необходимо интерпретировать кривые элюирования в тех случаях, когда калибровка и исследование разрешающей способности системы для фракционируемых образцов непосредственно не проводились. Если колонка не слишком перегружена образцом и показано, что характеристические элюирующие объемы воспроизводятся в серии кривых, можно провести калибровку. По-видимому, можно принять, что степень вытеснения из геля находящихся в конформации статистического клубка молекул в очень разбавленном растворе определяется величиной эффективного гидродинамического диаметра этих. [25]
В экспериментальных условиях фракционирования зона молекул растворенного вещества уширяется в процессе прохождения в нижнюю часть колонки в результате неоднородного заполнения носителем и возникновения локальных неравновесных условий, а также в связи со случайным распределением растворенных молекул между порами геля и его наружным объемом. Если молекулы растворенного вещества однотипны, в зоне устанавливается примерно гауссово распределение по концентрации [205], и, следовательно, кривая элюирования имеет гауссов характер. Число теоретических тарелок ( N) колонки равно квадрату отношения максимального элюирующего объема ( Ve) к стандартному отклонению ( 0) кривой элюирования. По формуле Глюкауфа [205] ширина р этой кривой, определенная на высоте i / e от ее максимума, используется для оценки числа N; ширина эта слабо зависит от хвостовой части фракции, что часто наблюдается в газовой хроматографии. Различные международные комиссии [206, 207] предложили пользоваться более удобной величиной w, определяемой как расстояние между касательными к кривой в точках перегиба. [26]
Строят кривую элюирования поливинилпирролидона, откладывая по оси ординат оптические плотности фракций D, а по оси абсцисс - элюирующие объемы фракций Ve. Кривая элюирования аналогична кривой молекулярно-массового распределения полимера. Необходимые для расчета параметры колонки Vo и ( Уо У) сообщаются преподавателем. Они определяются предварительно по элюирующим объемам соответственно очень больших и очень малых частиц. При расчете в качестве Vs принимают элюирующий объем, отвечающий максимуму на полученной кривой элюирования. По этому объему оценивают молекулярную массу с помощью калибровочной кривой. [27]
Строят кривую элюирования поливинилпирролидона, откладывая по оси ординат оптические плотности фракций D, а по оси абсцисс - элюирующие объемы фракций Ve. Кривая элюирования аналогична кривой молекулярно-массового распределения полимера. Необходимые для расчета параметры колонки Vo и ( Уо У) сообщаются преподавателем. Они определяются предварительно по элюирующим объемам соответственно очень больших и очень малых частиц. При расчете в качестве Vs принимают элюирующий объем, отвечающий максимуму на полученной кривой элюирования. По этому объему оценивают молекулярную массу с помощью калибровочной кривой. [28]
Страницы: 1 2