Получение - ген
Cтраница 1
Получение генов с помощью ПЦР - гораздо более быстрый и экономичный метод, чем тот, который основан на отжиге олигонуклеотидов с перекрывающимися концами, заполнении брешей с помощью ДНК-полимеразы и сшивании разрывов ДНК-лигазой. После отжига образуется дуплекс с заглубленными 3 -гидроксильными группами, служащими точками инициации синтеза комплементарных цепей при ПЦР. Затем в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотида, С и D. С идентичен 5 -концу олигонуклеотида А, а сам этот олигонук-леотид отвечает участку конструируемого гена, непосредственно примыкающему к его центральной части слева. Аналогично, 3 -конец олигонуклеотида D идентичен 5 -концу олигонуклеотида В и отвечает участку гена, примыкающему к его центральной части справа. [1]
Для получения полноразмерных генов другим способом тоже вначале синтезируют специфический набор перекрывающихся олигонуклеотидов длиной от 40 до 100 звеньев. При их отжиге происходит спаривание 6 - 10 3 - и 5 -концевых взаимно комплементарных нуклеотидов, а между ними остаются большие бреши. [3]
Рекомбинантная ДНК используется для получения искусственных генов. [4]
Последние достижения науки связаны с разработкой технологии генной инженерии, заключающейся в получении специфических генов ( отрезков ДНК) одного вида и введении их другому виду непосредственно без скрещивания. Это позволяет гибридизировать любые виды, не только близкородственные, и потому вызывает серьезные споры из-за непредсказуемости конечных результатов такого радикального вмешательства в генофонды живых существ. [5]
Процедура получения генно-инженерного гормона проводилась с учетом того, что просоматотропин не подвергается процессингу в бактериальной клетке. Был использован комбинированный метод получения гена соматотро-пина. [6]
РНК часто используют также для получения их ДНК-копий с помощью олигомера тимидиловой к-ты в качестве затравки и фермента обратной транскриптазы. Эти копии в свою очередь используют для получения индивидуальных генов методами генетич. [7]
Исследование биоразнообразия в природе ( in situ), в отличие от чистой культуры ( ex situ), проводится на основе экстракции суммарной ДНК из образца, очистки, амплификации, получения генов рРНК, их секвенирования и сопоставления с имеющимся компьютерным банком данных. Таких исследований сейчас очень много и они позволяют вести мониторинг сложных микробных сообществ с идентификацией клонов рДНК - гена. Другой прием заключается в применении генных проб, позволяющих сразу же установить принадлежность организмов к той или иной ветви. [8]
Что же касается выделения специфических генов из фрагментиро-ванных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название шотган ( от англ, shotgun - дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомби-нантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом. Одна из таких процедур описана в разд. [9]
Затем можно сконструировать ген из нуклеотидов ( напомним, что каждое основание является частью одного нук-леотида), соединив их друг с другом в правильном порядке. Сейчас таким способом удается конструировать только короткие гены, однако с усовершенствованием методов синтез любого гена станет рутинной процедурой. Этот метод был использован для получения генов проинсу-лина и соматостатина. Соматостатин ( известный также как ингибитор гормона роста) - это белковый гормон, состоящий всего из 14 аминокислот. [10]
Другими словами, как сказано в одном из нормативных документов, то, что не является предопределенным, не может считаться очевидным. Тем не менее РТО США придерживается существующего подхода к патентованию генов и недавно отклонил по крайней мере одну заявку на том основании, что методы, которые использовались для определения нуклеотидной последовательности гена, были рутинными и очевидными. Патентные поверенные в свою очередь считают, что патентоспособность изобретения не зависит от того, каким образом оно было сделано, а определяется тем, соответствует ли оно условиям патентоспособности. Вопрос о том, является ли использование известного способа получения гена препятствием к признанию такого гена неочевидным, следует решать в судебном порядке. Поскольку РТО использует прецедентный подход к вынесению решений по биотехнологическим заявкам, по-видимому, не существует абсолютного стандарта для оценки соответствующих изобретений, и суды скорее будут играть интегративную роль при рассмотрении вопроса о патентоспособности генов. [11]
История развития генной инженерии насчитывает не более тридцати лет. Ее становление связано с конструированием векторных молекул, получением рекомбинантных ДНК, а также включением в векторы генов животных и человека. Невозможно связать генную инженерию с одним каким-либо открытием, так как она представляет собой совокупность приемов и методов, направленных на создание искусственно модифицированных генетических программ. В предыдущей главе рассмотрены процессы генетической рекомбинации, происходящие при синтезе антител в природных условиях. Возможно эти процессы и явились толчком для проведения опытов, связанных с получением рекомбинантных генов искусственным путем. [12]
Гены, кодирующие а-амилазу, были выделены из многих микроорганизмов, в том числе из В. Для этого экстрагировали их хромосомную ДНК, частично гидролизовали ее рестрицирующей эндонуклеазой Sau3AI и встроили в обработанную рестриктазой BamHl плазмиду pUBHO, которая содержит уникальный BamHI - саРп и несет ген устойчивости к ка-намицину. Колонии, продуцирующие а-амилазу, были окружены четко различимым гало, что свидетельствовало о гидролизе крахмала вблизи них. Возможность получения генов а-амилазы из разных источников позволила исследователям внести в них изменения, необходимые для того, чтобы эти гены можно было использовать в конкретных промышленных процессах. [13]
Первый и второй методы имеют ограниченное применение. Вьщеление однородных фрагментов ДНК осуществляется при помощи ферментов-рестриктаз, которые узнают и расщепляют ДНК в строго фиксированных точках. Эти ферменты функционально связаны с модифицирующими метилазами следующим образом: метилазы осуществляют метилирование в сайтах ДНК, которые атакуются рестриктазами. Метилирование защищает собственную ДНК клетки от неспецифической фрагментации, в то время как чужеродная ДНК немедленно разрушается. В месте разрыва полинуклеотид-ных цепей образуются, в частности, липкие концы, способные образовывать между собой комплементарные пары оснований. Арбером рестрикции и использование ее для получения генов было отмечено Нобелевской премией. [14]
Страницы: 1