Cтраница 1
Порядок чередования аминокислотных остатков в полипептидных цепях ( называемый первичной структурой) впервые именно таким образом был установлен для белка инсулина. Последовательности аминокислот в короткой и длинной цепях были определены в период 1945 - 1952 гг. Сенгером и его сотрудниками. Обе цепи в молекуле инсулина соединены дисульфидными связями S-S, образованными между остатками дистина. [1]
Порядок чередования аминокислотных остатков, называемый первым порядком организации белковой молекулы, не может объяснить всех свойств белков. Особенное значение здесь приобретает расположение полипептидной цепи в пространстве. В соответствии с валентными углами и взаимным расположением аминокислотных остатков полипептидная цепь на большей части своего протяжения или на всем протяжении бывает обычно изогнута в виде спирали. Это называется вторым порядком организации, или вторичной структурой. [2]
Порядок чередования аминокислотных остатков в полипептидных цепях ( называемый первичной структурой) впервые был установлен для белка инсулина. [3]
Последующее изучение порядка чередования аминокислотных остатков в исследуемых актиномицинах показало, что аурантин представляет собой смесь актиномицинов группы С, содержащих в своем составе аллоизолейцин. [4]
К сожалению, этот изящный метод имеет ряд недостатков, которые затрудняют изучение С-концевых аминокислот и порядок чередования аминокислотных остатков. Так, скорость отщепления отдельных аминокислот неодинакова. Быстрее всего отщепляются ароматические аминокислоты, затем аминокислоты с длинной алифатической цепью и затем уже с короткой. Очень медленно отщепляются дикарбоновые и диаминокислоты. Совсем не отщепляются пролин и оксипролин. На скорость отщепления влияют и характер соседнего аминокислотного остатка, и общая структура белковой молекулы. Это часто затрудняет интерпретацию получаемых результатов. Например, при одинаковой интенсивности накопления нескольких аминокислот не всегда можно быть уверенным в существовании нескольких полипептидных цепей, если эти кислоты отщепляются с различной скоростью. Поэтому в ряде случаев результаты, полученные с помощью карбоксипепсидазного метода, требуют дополнительной проверки. [5]
В задачу исследования входил поиск путей и методов выделения и идентификации такого рода соединений, анализа функциональных групп, установления молекулярного веса, аминокислотного состава, порядка чередования аминокислотных остатков в молекуле пептида и, наконец, разработка путей встречного синтеза пептидов и циклопепти-дов с окончательным установлением структурной формулы антибиотика. [6]
Четвертой, не упомянутой выше, но приобретающей в последнее время все больший интерес, задачей, разрешаемой при помощи химического изменения белков, является применение его в качестве вспомогательного средства при исследовании порядка чередования аминокислотных остатков. Работа в этом направлении была существенно облегчена введением метода Зангера [9] и весьма широко проводится английскими биохимиками. Новый способ отличается от обычного способа приготовления белковых производных или измененных белков тем, что полученные соединения гидролизуют и образующиеся производные аминокислот изолируют. Часто этим способом исследуют структуру не только нативных белков, но и продуктов неполного ферментативного или кислотного гидролиза, а также структуру продуктов частичного окисления. При разрыве поперечных цистиновых связей ( - S-S -) путем окисления до остатка цистеиновой кислоты ( - SO3H), которое также было введено Зангером [10], молекула белка распадается на отдельные полипептидные цепи. [7]
Реакция с 2 4-динитрофторбензолом ( ДНФБ), введенная Зан-гером [9], представляет собой реакцию алкилирования, которая, как это видно из приведенных выше примеров, приобрела большое значение при исследовании концевых групп и при установлении порядка чередования аминокислотных остатков в белках. Однако этот реагент оказался малополезным при изучении свойств белков и их биологической активности ( 74а, 169, 170, 172, 175) ДНФБ количественно реагирует со свободными аминогруппами белка, образуя динитрофенил - ( ДНФ -) производные последнего. Эту реакцию проводят в бикарбонатном растворе в мягких условиях, при которых не происходит гидролиз пептидных связей. При определении концевых аминокислот ДНФ-производные белка подвергают полному гидролизу сильной кислотой. При этом выделяются стабильные ДНФ-аминокислоты, которые благодаря их желтой окраске можно после хроматографического разделения идентифицировать и количественно определить колориметрическим способом. При определении порядка чередования аминокислотных остатков в белке последний подвергают только частичному гидролизу при помощи кислоты или фермента. Образующиеся при этом пептиды обрабатывают ДНФБ. Реакция с ДНФБ не является специфической реакцией на свободные а-амино-группы. Динитрофторбензол соединяется также с е - аминогруппами лизина с образованием е - ДНФ-лизина, который может быть идентифицирован. [8]
По количеству найденных концевых звеньев определяют еще число полипептидных цепей в молекуле белка. Эдманом создан сиквенатор, работающий по заданной программе и намного облегчающий установление порядка чередования аминокислотных остатков в макромолекуле. [9]
Во всех живых клетках белки синтезируются рибосомами. Рибосома представляет собой крупную макромолекулу со сложной асимметричной четвертичной структурой, построенной из рибонуклеиновых кислот ( рибосомных РНК) и белков. Для того чтобы синтезировать белок, рибосома должна быть снабжена а) программой, задающей порядок чередования аминокислотных остатков в полипептидной цепи белка; б) аминокислотным материалом, из которого надлежит строить белок; в) энергией. Сама рибосома обладает каталитической ( энзиматической) функцией, ответственной за образование пептидных связей и, соответственно, полимеризацию аминокислотных остатков в полипептидную цепь белка. [10]
Свободными аминогруппами в белке являются е-аминогруппы лизина и N-концевые или а-аминогруппы. Число последних соответствует количеству Полипептидиых цепей в молекуле. В последнее время предпринимаются попытки дифференцировать свободные я-амино - и свободные s - аминогруппы по их значению для биологической активности, е - Аминогруппы различаются своей реакционной способностью по отношению к кетену и ДНФБ, в то время как все исследованные до сих пор N-концевые группы белков легко вступают в реакцию с обоими этими реагентами. ДНФБ не является специфичным реагентом; однако при исследовании концевых групп или при определении порядка чередования аминокислотных остатков он обладает тем преимуществом, что производные его, образованные по аминогруппе, окрашены и, следовательно, могут быть идентифицированы после гидролиза и хроматографического разделения. Все перечисленные в табл. 1 вещества, за исключением специфических реагентов на сульф-гидрильную группу, P2Os, концентрированной серной кислоты и этерифицирующих агентов, легко вступают в реакцию с аминогруппами. В течение долгого времени для блокирования аминогрупп применяли обычно ряд ацилирующих реагентов, однако ни один из них не был действительно специфическим. [11]
Реакция с 2 4-динитрофторбензолом ( ДНФБ), введенная Зан-гером [9], представляет собой реакцию алкилирования, которая, как это видно из приведенных выше примеров, приобрела большое значение при исследовании концевых групп и при установлении порядка чередования аминокислотных остатков в белках. Однако этот реагент оказался малополезным при изучении свойств белков и их биологической активности ( 74а, 169, 170, 172, 175) ДНФБ количественно реагирует со свободными аминогруппами белка, образуя динитрофенил - ( ДНФ -) производные последнего. Эту реакцию проводят в бикарбонатном растворе в мягких условиях, при которых не происходит гидролиз пептидных связей. При определении концевых аминокислот ДНФ-производные белка подвергают полному гидролизу сильной кислотой. При этом выделяются стабильные ДНФ-аминокислоты, которые благодаря их желтой окраске можно после хроматографического разделения идентифицировать и количественно определить колориметрическим способом. При определении порядка чередования аминокислотных остатков в белке последний подвергают только частичному гидролизу при помощи кислоты или фермента. Образующиеся при этом пептиды обрабатывают ДНФБ. Реакция с ДНФБ не является специфической реакцией на свободные а-амино-группы. Динитрофторбензол соединяется также с е - аминогруппами лизина с образованием е - ДНФ-лизина, который может быть идентифицирован. [12]