Cтраница 2
Если анализируемая проба имеет сильнощелочную или сильнокислую реакцию, ее предварительно нейтрализуют по метиловому оранжевому, определяя необходимое количество щелочи или кислоты титрованием отдельной порции пробы. К подготовленному раствору приливают из микробюретки 1 мл титрованного раствора дитизона, встряхивают 1 - 2 мин, дают жидкости-разделиться на два слоя и сливают нижний слой органического растворителя в пробирку. Затем обрабатывают водный раствор 1 мл раствора дитизона и полученный экстракт собирают во вторую пробирку. Так продолжают, приливая каждый раз по 1 мл раствора дитизона и собирая экстракты в новые пробирки, пока вместо окрашенного в оранжево-желтый цвет экстракта ( дитизонат ртути) не получится экстракт зеленого цвета ( свободный дитизон) или промежуточной окраски. [16]
Внедрение личинок в агар происходит в тех случаях, когда ими полностью потреблены питательные вещества в кусочках печени или почек и агар начинает подсыхать. Пропитывая ватную пробку пробирки парафином, можно замедлить высыхание агара, однако, если полностью прекратить доступ воздуха в пробирку, культура быстро погибает. Признаком гибели культуры являются личинки, вытянувшиеся в длину и лежащие рядами друг возле друга на стекле пробирки. Пробирки необходимо периодически открывать и подвижные стадии нематод, находящиеся на кусочках печени ( почек), переносить в новые пробирки. [17]
К сернокислотному раствору добавляют 20 мл воды, отфильтровывают нерастворимый остаток и промывают несколько раз горячей водой. Фильтрат собирают в мерную колбу емкостью 200 или 100 мл и доводят объем его до метки водой. Отбирают в делительную воронку аликвотную часть раствора, прибавляют 10 мл 0 1 М раствора ЭДТА, 1 каплю раствора метилового оранжевого и 20 % - ный раствор едкого натра до перехода розовой окраски в желтую. Титрование проводят следующим образом: приливают из микробюретки 1 мл титрованного раствора дитизона, встряхивают 1 мин, дают жидкости разделиться на два слоя и сливают органический слой, содержащий дитизонат ртути. Так продолжают титрование, приливая каждый раз по 1 мл раствора дитизона и собирая экстракты в новые пробирки, пока вместо окрашенного в оранжево-желтый цвет экстракта ( дитизонат ртути) не получат экстракт зеленого цвета ( свободный дитизон), что указывает на конец титрования. Экстракт ее смешанной окраской считают содержащим 0 5 мл раствора сво бодного дитизона. [18]
Питательную среду в лаборатории Вейзера готовили иначе, чем у Глезера и др. Здоровых мышей убивали ударом, в стерильных условиях извлекали из них почки и печень и в камере Гансена помещали в стерильный 0 6 % - ный раствор поваренной соли с добавкой 1 мг хлорамфеникола. Несмотря на то что хлорамфеникол нетоксичен для нематод, в питательных средах, где для сохранения органов мыши в течение 24 часов применяли антибиотики, развитие нематод замедлялось. Питательная среда в течение 24 часов проверяется на стерильность. Перенос нематод из такой культуры в другие пробирки с питательной средой производят платиновой иглой, которой соскабливают осадок с поверхности кусочка печени или почки вместе с содержащимися в нем подвижными стадиями нематод и переносят их на орган в новой пробирке, которую в дальнейшем держат наклонно или горизонтально при температуре 20 - 25 С в течение 3 - 5 дней. При таком способе культура нематод может сохраняться 2 - 3 месяца. [19]
В одну из пробирок, при перемешивании, приливают концентрированную азотную кислоту до растворения осадка. Первую пробирку промывают 2 - 3 каплями концентрированной азотной кислоты, которые также переносят во вторую пробирку. Перемешивая, добавляют по каплям концентрированную азотную кислоту во вторую пробирку до растворения осадка. В случае необходимости пользуются капельницей. Точно так же переносят раствор в третью и четвертую пробирки. Раствор, объединенный в четвертой пробирке, переносят в две чистые центрифужные пробирки емкостью по 90 мл. Объем раствора а обеих пробирках делают одинаковым. Четвертую пробирку промывают концентрированной азотной кислотой, сливая промывки в две новые пробирки с раствором. [20]