Cтраница 2
Белки удобно наносить последовательно в порядке уменьшения их молекулярной массы с интервалом, зависящим от размера колонки. Во время нанесения белков колонку перекрывают. Строят профиль элюции отдельных белковых фракций ( с. Затем строят график зависимости отношения объема выхода белка к свободному объему колонки Ve / V0 или величины Kav от логарифма молекулярной массы белков. [16]
Выбор варианта зависит от технических средств, опыта и тради - ЦРХЙ данной лаборатории. В любом случае при первоначальной отработке методики, а также для каждой новой колонки или партии сили-кагеля требуется терпеливый поиск оптимальных условий хроматографии. Это не так уж обременительно, если учесть, что при грамотной эксплуатации на одной колонке можно провести до 1000 опытов. Раз установленные условия хроматографии должны очень точно и по всей совокупности рабочих параметров воспроизводиться от опыта к опыту. Основное назначение хроматографии ФТГ-АК, как мы видели, состоит в идентификации одиночных аминокислот в ходе секвенирования белка. При этом не возникает затруднений с разделением пиков, но зато решается еще более трудная задача - по положению пика па профиле хроматографической элюции ( по времени задержки на колонке) надежно идентифицировать аминокислоту. Незначительные изменения рН, температуры, состава смеси или скорости элюции могут привести к сдвигу пика в ту или другую сторону, а такой сдвиг, даже если он измеряется секундами по времени задержки, может повлечь за собой ошибку в идентификации. [17]
Недавняя работа Беннет и соавторов посвящена очистке адренокортикотропного гормона ( АКТГ) - пептида, состоящего из 39 аминокислотных остатков. Прежде чем привести их методику очистки АКТГ, целесообразно привести из той же работы наглядный пример влияния выбора контриона на результат хроматографического фракционирования пептидов. Как видно из сопоставления верхнего и нижнего профилей на рис. 94 ( высокий фон на нижнем профиле - поглощение ГФМК при 210 нм), смена контриона коренным образом изменяла не только расположение пиков пептидов па профиле элюции, но даже порядок их выхода из колонки. [18]