Cтраница 1
Разделение производных аминокислот с помощью ГХ, которое было описано в предыдущих разделах, наталкивается на ряд трудностей, объясняемых несколькими причинами. Как уже упоминалось, раствор природных аминокислот представляет собой сложную смесь соединений различной летучести и полярности. Для этой смеси характерен широкий интервал удерживаемых объемов и необходимы высокие температуры разделения. В некоторых случаях, например для метиловых эфиров ДНФ-аминокислот, ГХ-анализ удается провести только на коротких колонках с малым количеством жидкой фазы. С другой стороны, наиболее летучие простые аминокислоты представляют собой близкие по структуре ( в некоторых случаях изомерные) соединения, и для их разделения необходимы колонки с высокой избирательностью. Положение может еще более осложниться из-за того, что некоторые О-замещен-ные оксиаминокислоты выходят в тех же интервалах удерживаемых объемов и их пики могут накладываться на пики вышеупомянутых аминокислот. Этим проблемам уделяется особое внимание в работе [ 191, где показано, что, несмотря на использование более 80 различных жидких фаз, так и не удалось количественно разделить н-амиловые эфиры следующих ТФА-аминокислот: Ала, Вал, Гли, Иле, Лей, Сер, Тре. В данном случае неудачное разделение происходит главным образом из-за О-ТФА-производных Сер и Тре. Как многократно наблюдали, производные со свободной ОН-груп-пой имеют большие удерживаемые объемы и не мешают разделению. [1]
Разделение производных аминокислот очень важно при определении строения пептидов. Для этой цели используют реакции белков и пептидов с 2 4-динитрофторбензолом, 1-диметиламино-нафталин - 5-сульфонилхлоридом или фенилизоцианатом с последующим распадом до динитрофениламинокислот, 1-диметилами-нонафталинсульфониламинокислот ( ДАНС - или ДНС-аминокис-лоты) и фенилтиогидантоинов соответственно. Методика приготовления этих производных описана в литературе ( ДНФ [94-97], ДАНС [98-101], ФТГ [102-106]) и здесь не рассматривается. Росмус и Дейл [ 106а - 106в ] обобщили работы по методам идентификации N-концевых аминокислот в пептидах и белках. [2]
Широкое применение хроматография в тонком слое получила для разделения производных аминокислот - фенилтиогидантоиновых и дансильных ( 5-диметилами-нонафтилсульфонильных) производных, широко используемых для анализа аминокислот в химии пептидов и белков. [3]
Разнообразие имеющихся в настоящее время жидких фаз ГХ, многие из которых применялись для разделения производных аминокислот, ставит исследователя в затруднительное положение. В ряде работ [13, 14, 27, ,29, 40] проведена оценка приблизительно 100 неподвижных фаз, включая силиконы, поверхностно-активные соединения, полиэфиры, полигликоли, ме-таллоорганические соединения и многие другие. [4]
Большинство последних работ [23, 26, 27, 29-39] по определению оптической чистоты и разделению диастереомеров методом газовой хроматографии посвящено разделению производных аминокислот, таких, как эфир N-трифторацетиламинокислот с ( -) - ментолом [26, 33] и несколькими к-алканолами-2 [29-32], а также производных, в которых а-хлоризовалероильный [27] или а-хлорпропионильный [37] радикалы ( радикал Б) присоединены к аминной функции. Разделение обычно проводят на капиллярных колонках, хотя в некоторых случаях эффективны также набивные колонки. [5]
Файбуш в 1971 году [110] предложил в качестве стационарной [ разы т-рег-бутиламид М - лауроил - Ь - валива, имеющий общую с пептидной фазой группировку - NH-СО-C H ( R) - - NH-СО -, способную участвовать в образовании трех водородных связей с расщепляемым рацематом. Расщепление метиловых эфиров N-ТФА-аминокислот на этой фазе происходит со значениями фактора расщепления 1 17 - 1 28, сравнимыми с лучшими результатами, полученными при разделении диастереомерных производных аминокислот на неактивных фазах. [6]
Эффективные подвижные фазы были подобраны для разделения лишь небольшой группы изученных веществ. Например, буферный 0 1 М раствор пиридина и уксусной кислоты с рН 2 8 ( 5 0 М уксусная кислота), в частности, пригоден для разделения кислотных производных аминокислот и аминосахаров. Градиентное элюирование буферными растворами пиридина и уксусной кислоты с рН 2 8 и 3 85 соответственно позволяет отделять кислотные и нейтральные аминокислоты от мурамовой и гексо-заминуроновых кислот, а также глюкозамина, галактозамина, хиновозамина и фукозамина. При помощи лишь буферного 0 133 М раствора пиридинуксусная кислота ( концентрация ук-кусной кислоты 0 82 М) с рН 3 85 достигнуто удовлетворительное разделение 2-амино - 2-дезокси - и З - амино-3 - дезоксигексоз и их 6-дезоксипроизводных, причем разделению не мешали присутствующие аминокислоты. [7]
Поскольку получаемые производные аминокислот имеют существенно различный характер, влияние носителя в общем виде оценить достаточно трудно. Однако в целом анализ производных аминокислот в большинстве случаев производится с использованием носителей повышенной инертности, таких, как газхром Р, хромо-сорб Q и силанизированные твердые носители. Это позволяет улучшить симметрию пиков при разделении производных аминокислот. [8]
Производные исследованных аминокислот на колонке с тетра-о-толилсиликатом ( TAS-10) разделялись в обычной последовательности, а именно: аланин, серии, валин, глицин, изолейцин, лейцин. Неподвижные жидкие фазы типа СПАН-80 эффективны для разделения ацетильных производных аминокислот, а ПЭГ 20М - для N-ТФАпроизводных, хотя и в меньшей степени. [9]
Тогдэ же было отмечено, что в качестве подвижной фазы может быть использована не только жидкость, но и газ. Далее эти ученые предложили осуществлять разделение производных аминокислот на смоченной водой бумаге с бутанолом в качестве подвижной фазы. [10]
Тогдэ же было отмечено, что в качестве подвижной фазы может быть использована не только жидкость, но и газ. Далее эти ученые предложили осуществлять разделение производных аминокислот на смоченной водой бумаге с бутанолом в качестве подвижной фазы. [11]
Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. [12]
Вероятно, трудно найти в органической химии и биохимии более удачный пример столь тесной взаимосвязи развития представлений о структуре и функциях большого класса веществ, каким являются белки, с хроматогра-фическими методами анализа. Газожидкостная и жидкостная колоночная хроматографии находят в этой области ограниченное применение, однако интерес к последнему методу постепенно растет. Интерес к жидкостной хроматографии вызван вполне определенными причинами. Во-первых, постоянно появляются новые методы избирательной модификации остатков аминокислот в белках, а идентификация производных аминокислот требует развития хроматографических методов. Во-вторых, исследованию подвергают все более труднодоступные белки, что в свою очередь вызывает необходимость создания надежных методов количественного анализа. Интерес к колоночной хроматографии возрастает также в связи с выделением и получением необычных аминокислот, а также в связи с необходимостью предотвращения ошибок при определении аминокислотной последовательности. Насколько известно, до сих пор не пытались использовать скоростную хроматографию высокого разрешения для разделения производных аминокислот, хотя некоторые соединения, например ДНС-аминокислоты, являются для этого метода довольно удобным объектом. Производные аминокислот использовали в структурном анализе белков крайне неравномерно. [13]