Cтраница 1
Безбелковый раствор того же буфера осторожно наслаивали на белковый раствор. [1]
Неорганический фосфат определяют прямо из полученного безбелкового раствора. [2]
Определение свободного креатина проводят в безбелковом растворе, используя цветную реакцию с диацетилом в присутствии а-наф-тола. [3]
В пробирки, содержащие 25 - 100 мг ткани, 1 мл гомогената или безбелкового раствора, добавляют по 3 мл 30 % - ного раствора едкого калия. Пробы закрывают пробками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры, содержимое пробирок количественно переносят в мерные колбочки на 25 - 50 мл в зависимости от содержания гликогена в пробах ( 1 мл получаемого раствора должен содержать от 3 до 30 мкг гликогена) и объем доводят водой до метки. В широкие пробирки берут по 2 5 мл полученного раствора, ставят их в лед, добавляют при встряхивании 5 мл раствора антрона, тщательно перемешивают, погружают на 10 мин в водяную баню при 90 С, затем охлаждают и фотометрируют при 620 нм. [4]
Осадок белка сразу удаляют фильтрованием или центрифугированием. Из безбелкового раствора быстро отбирают пробу и вносят в 1 5-кратный объем магнезиальной смеси, предварительно налитой в пробирки, стоящие во льду. Проверяют реакцию среды, добавляя в пробы по капле фенолфталеина. После тщательного перемешивания пробирки оставляют во льду на 30 - 40 мин, периодически их встряхивая. Образовавшийся осадок аммониевомагниевой соли фосфорной кислоты удаляют фильтрованием. [5]
Пробы 3 - 6 после добавления экстракта ставят в водяной термостат при 37 С на инкубацию. В безбелковом растворе каждой пробы определяют содержание гликогена и молочной кислоты с л-оксидифенилом. [6]
По окончании инкубации пробы вынимают из термостата, помещают в лед и приливают равный объем охлажденного 5 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты. Осадок белка удаляют центрифугированием, в безбелковом растворе определяют неорганический фосфат. [7]
Раствор хорошо перемешивают, осадок белка удаляют фильтрованием или центрифугированием. Если в растворе присутствуют кислотолабильные фосфорные соединения, то фильтрование или центрифугирование проводят на холоде, а кислоту из безбелкового раствора удаляют. [8]
После этого экстракт ткани добавляют в пробы 3 - 6, пробирки ставят в водяной термостат при 37 С. В безбелковом растворе определяют содержание глюкозы и молочной кислоты. [9]
Пробы 3 - 6 после добавления экстракта мышц ставят на инкубацию в водяной термостат при 37 С. После инкубации пробирки помещают в лед и в каждую приливают равный объем хлорной кислоты. В безбелковом растворе определяют содержание гликогена, фруктозо-1 6-фосфата и молочной кислоты. [10]
После добавления экстракта пробы 3 - 6 ставят на инкубацию в водяной термостат при 26 С. После инкубации пробирки помещают в лед и в каждую добавляют по 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты. В безбелковом растворе определяют фруктозе-1 6-дифосфат и молочную кислоту. Если предполагают определять содержание фосфоглицериновой кислоты методом бумажной хроматографии и молочной кислоты энзиматическим методом, белки осаждают хлорной кислотой. [11]
Пробы 3 - 10 после добавления экстракта ставят в водяной термостат при 26 С на инкубацию. После инкубации их помещают в лед л добавляют по 3 мл трихлоруксусной кислоты. В безбелковом растворе определяют фруктозе-1 6-дифосфат по фруктозе. Рассчитывают убыль фруктозодифосфата в процессе инкубации. Полученные данные представляют в виде диаграммы. [12]
В пробы 1 и 2 ( пробы до инкубации) приливают по 3 мл 5 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты до добавления гомогената. Пробы 3 - 8 инкубируют при 37 С в водяном термостате указанное время. По окончании инкубации в них добавляют по 3 мл 5 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты. Все пробы фильтруют или центрифугируют и в безбелковом растворе определяют неорганический фосфат. [13]
Остальные пробы после добавления ферментативного препарата перемешивают и ставят на инкубацию в условиях, указанных в каждой конкретной методике. После инкубации пробы снова помещают в лед, к реакционной смеси добавляют трихлоруксусную-или хлорную кислоту до конечной концентрации 2 5 %, перемешивают и оставляют на холоде. Через 10 мин осадок денатурированного белка удаляют фильтрованием или центрифугированием. Если закисление реакционной среды нежелательно, ферментативную реакцию останавли-твают, нагревая пробы в кипящей водяной бане. В полученных безбел-гковых растворах определяют содержание субстратов и продуктов ре - акции. Предварительно рассчитывают их примерное возможное количество в каждой пробе. Учитывая возможное содержание исследуемого вещества в пробе, берут несколько аликвот для определения. При необходимости безбелковый раствор разводят дистиллированной водой. Рассчитывают убыль субстрата и прирост продуктов реакции в микромолях на пробу с учетом всех разведений. Результаты оформляют в виде таблицы или графика. [14]
Заполнение проб проводят следующим образом. Во все пробирки наливают раствор фруктозо-1 6-дифосфата и буфер. Первые три пробирки оставляют при 20 С, а четвертую помещают в термостат при 60 С на 5 мин. Одновременно в тот же термостат помещают небольшое количество приготовленного диализованного экстракта. Большую часть экстракта оставляют при комнатной температуре. Через 5 мин во вторую и третью пробирки добавляют экстракт, стоящий при 20 С, а в четвертую экстракт, стоящий при 60 С. Содержимое пробирок перемешивают и проводят инкубацию по схеме. Затем во все пробы добавляют равный объем 5 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и осадок белка удаляют центрифугированием или фильтрованием. В безбелковом растворе проводят определение трио-зофосфатов ( в пробах, взятых на анализ, предварительно нейтрализуют трихлоруксусную кислоту) и фруктозо-1 6-дифосфат. [15]