Cтраница 2
После 30 мин окрашивания окрашивающий раствор сливают и агаровую пластинку заливают дифференцирующим раствором. Затем препарат обрабатывают отмывающим раствором, меняя его каждые 15 мин, пока не прекратится элюирование красителя. [16]
Отмывающий раствор: 5 % - ный раствор уксусной кислоты. При отмывании следует менять отмывающий раствор каждые 15 мин. [17]
После 1 - 2-минутной экспозиции отмывающий раствор Хенкса удаляют из пробирок с помощью пипетки. [18]
Фиксированные нагреванием электрофореграммы на 15 мин погружают в окрашивающий раствор, а затем на 15 мин переносят в дифференцирующий раствор. После этого, каждые 20 мин меняя отмывающий раствор, электрофореграммы промывают до тех пор, пока участки бумаги, не содержащие белка, полностью не освободятся от красителя. [19]
Отмывающий раствор: смешивают 830 мл дистиллированной воды, 20 мл уксусной кислоты и 150 мл глицерина. После окрашивания в течение 5 ч агаровые пластинки отмывают, меняя каждые 20 мин отмывающий раствор, пока не содержащие белка участки агара не освободятся от красителя. [20]
Фиксированные электрофореграммы сворачивают, на 2 - 3 мин погружают в нагреваемый на водяной бане до кипения метанол, а затем 4 мин окрашивают раствором амидового черного, имеющим температуру 80 С. После окрашивания полоски расправляют на стекле, оставляют на 5 мин и затем промывают в отмывающем растворе, нагретом до 80 С, пока не удалят избыток красителя. [21]
Распределение пятен на хроматограмме показано на фиг. Полиамидные пластинки можно применять несколько раз, если их тщательно отмывать после каждого опыта следующим образом: пластинку погружают в 50 % - ный ацетон, содержащий 1 М NH4OH, стараясь не касаться стенок сосуда, и отмывают 2 ч, постоянно перемешивая отмывающий раствор. [22]
К 0 2 мл исследуемого раствора белка ( в центрифужной пробирке) добавляют 1 0 мл дистиллированной воды, затем пипеткой в пробирку вносят сначала 1, а затем после тщательного перемешивания еще 4 мл красителя. Встряхивают несколько раз и оставляют смесь на 20 мин при комнатной температуре; центрифугируют при 2000 об / мин 10 мин, надосадочную жидкость осторожно сливают или отсасывают пипеткой. Осадок промывают отмывающим раствором до тех пор, пока надосадочная жидкость после очередного центрифугирования не останется бесцветной. Отмытый осадок растворяют в 5 мл растворителя и измеряют оптическую плотность в 1-сантиметровой кювете со светофильтром S-61 при 595 нм против контроля. [23]
Перед окрашиванием на высушенную агаровую пластинку наливают 10 % - ную уксусную кислоту и оставляют ее на 10 мин. Затем уксусную кислоту сливают и на 60 мин заливают препарат раствором амидового черного. После этого краситель сливают, а избыток его удаляют отмывающим раствором, меняя этот раствор каждые 15 мин, пока он не будет оставаться бесцветным. [24]
Фиксированные электрофореграммы на 5 мин погружают в окрашивающий раствор, переносят в I дифференцирующий раствор, а потом на 15 мин во II дифференцирующий раствор. После этого бумагу отмывают чистым метанолом. При необходимости можно очень быстро высушить электрофореграммы, погружая их в эфир и извлекая на воздух. Вместо метанола отмывающим раствором может служить 0 5 % - ная уксусная кислота. [25]
Для анионообменной хроматографии белков обычно применяют ДЭАЭ-сефадекс А-50. Затем ионообменник отмывают от но-нов С1 - 0 5 М NaOH. Избыток щелочи отмывают дистиллированной водой и продолжают дальнейшее отмывание кислотой. В связи с тем, что белки сыворотки крови обычно фракционируют в фосфатном буферном растворе, в качестве кислого отмывающего раствора применяют 0 1 М фосфорную кислоту. Избыток кислоты в свою очередь отмывают дистиллированной водой, а затем ионообменник отмывают стартовым буферным раствором до тех пор, пока не наступит равновесие. Проще всего отмывание вести фильтрованием на воронке Бюхнера, поскольку при этом удобно не только отмывать, но и анализировать промывную жидкость. [26]
Исследованиями процесса отмывки установлено, что время контакта ионита с отмывающим раствором, необходимое для полной нейтрализации и замещения серной кислоты в грануле сополимера составляет примерно 2 5 часа, что значительно превышает скорость реакции взаимодействия серной кислоты с карбонатом аммония, поэтому процесс отмывки можно рассматривать как процесс обмена сульфогруппами ионита с отмывающим агентом и расчет аппарата свести к нахождению протяженности зоны отмывки в зависимости от концентрации сульфогрупп в выходящем из аппарата растворе. Зная распределение концентрации сульфогрупп по длине аппарата, нетрудно рассчитать распределение температуры по длине аппарата. Для поддержания определенного температурного режима в реакционном пространстве аппарата необходимо отвести все тепло, выделяющееся при нейтрализации серной кислоты, карбонатом аммония. Задача выбора теплового режима работы аппарата сводится к нахождению расхода охлаждающего агента в зависимости от температуры реакционной массы при стабилизации подачи ионита и отмывающего раствора в аппарат, количественное соотношение которых рассчитывается, исходя из времени контакта ионита с отмывающим раствором, необходимым для понижения концентрации сульфогрупп в грануле ионита до заданного значения. [27]
Исследованиями процесса отмывки установлено, что время контакта ионита с отмывающим раствором, необходимое для полной нейтрализации и замещения серной кислоты в грануле сополимера составляет примерно 2 5 часа, что значительно превышает скорость реакции взаимодействия серной кислоты с карбонатом аммония, поэтому процесс отмывки можно рассматривать как процесс обмена сульфогруппами ионита с отмывающим агентом и расчет аппарата свести к нахождению протяженности зоны отмывки в зависимости от концентрации сульфогрупп в выходящем из аппарата растворе. Зная распределение концентрации сульфогрупп по длине аппарата, нетрудно рассчитать распределение температуры по длине аппарата. Для поддержания определенного температурного режима в реакционном пространстве аппарата необходимо отвести все тепло, выделяющееся при нейтрализации серной кислоты, карбонатом аммония. Задача выбора теплового режима работы аппарата сводится к нахождению расхода охлаждающего агента в зависимости от температуры реакционной массы при стабилизации подачи ионита и отмывающего раствора в аппарат, количественное соотношение которых рассчитывается, исходя из времени контакта ионита с отмывающим раствором, необходимым для понижения концентрации сульфогрупп в грануле ионита до заданного значения. [28]