Cтраница 1
Рабочий реактив для определения глюкозы готовится за 1 - 2 ч до употребления. В 80 мл ацетатного буфера ( рН 4 8) растворяют 1 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, приливают 1 мл 1 % - ного раствора о-толидина и доводят объем до 100 мл ацетатным буфером. Реактив может храниться в холодильнике в темных склянках в течение нескольких суток. [1]
Рабочим реактивом служит свежеприготовленный 1 % раствор диазотированной сульфаниловой кислоты в 5 % уксусной кислоте. [2]
К 1 мл центрифугата прилийают 3 мл рабочего реактива, перемешивают и развившуюся синюю окраску колориметрируют в кювете шириной 5 мм. Окраска стабильна в течение нескольких минут. Время, необходимое для развития максимальной окраски, зависит от активности глюкозооксидазы и должно быть найдено экспериментально. Для этого берут одну из проб и начиная с 10 - й минуты измеряют на ФЭКе ее оптическую плотность. [3]
В сухую пробирку ( присутствие следов воды мешает развитию окраски) вносят 2 мл рабочего реактива ( реактив отмеривают стеклянным цилиндром) и 0 1 мл негемолизированной сыворотки. Сыворотку добавляют медленно, так чтобы она стекала по стенке пробирки. Пробирку энергично встряхивают 10 - 12 раз и помещают в термостат при 37 С на 20 мин. [4]
Для приготовления контрольной пробы ( одна-две пробы на группу) в сухую пробирку отмеривают 2 мл рабочего реактива. [5]
Чтобы учесть все возможные ошибки, обычно проводят так называемый глухой опыт, при котором проделывают все операции на тех же рабочих реактивах, но без участия анализируемого вещества. [6]
Если за 10 - 15 мин окраска не достигнет максимума, это указывает на низкую активность глюкозооксидазы. В таком случае при приготовлении рабочего реактива ее количество следует увеличить. [7]
Ввиду того что сернокислый цинк и щелочь частично ингибируют глюкозооксидазу, для построения стандартного графика к 0 1 мл раствора глюкозы приливают хлористый натрий, сернокислый цинк и едкий натр в тех же количествах, которые использовались для осаждения белков крови. После центрифугирования отбирают из стандартных проб по 1 мл раствора и добавляют по 3 мл рабочего реактива. Стандартный график строят для каждой серии определений. [8]
Влияние посторонних ионов устраняют путем связывания их соответствующим реактивом в бесцветный комплекс. Относительная прочность окрашенных соединений определяемого и мешающего ионов здесь существенного значения не имеет, поскольку дополнительный маскирующий реактив выбирается таким образом, что от его введения окрашенный комплекс МмешК постороннего иона Ммеш разрушается, в то время как окрашенное соединение MRn определяемого иона М остается без изменений. Для этого необходимо, чтобы прочность комплекса постороннего иона с маскирующим реактивом была больше, чем прочность комплекса его с рабочим реактивом. Так, определяют ионы кобальта роданидным методом в присутствии ионов железа. В качестве маскирующего реактива используют раствор фторид-ионов, которые связывают Fe3 в бесцветный фторидный комплекс. Хотя роданид кобальта является менее прочным комплексным соединением, чем роданид железа, тем не менее влияние последнего полностью устраняется, поскольку комплекс Fes с маскирующим реактивом ( фторид-ионом) прочнее роданида железа, а роданид кобальта, наоборот, прочнее комплекса фторида кобальта. [9]
Влияние посторонних ионов устраняют путем связывания их соответствующим реактивом в бесцветный комплекс. Относительная прочность окрашенных соединений определяемого и мешающего ионов здесь существенного значения не имеет, поскольку дополнительный маскирующий реактив выбирается таким образом, что от его введения окрашенный комплекс МмешКи постороннего иона Миеш разрушается, в то время как окрашенное соединение МКЯ определяемого иона М остается без изменений. Для этого необходимо, чтобы прочность комплекса постороннего иона с маскирующим реактивом была больше, чем прочность комплекса его с рабочим реактивом. Так определяют, например, ионы кобальта роданпдным методом в присутствии ионов железа. В качестве маскирующего реактива используют раствор фторид-ионов, которые связывают Fe3 в бесцветный фторидный комплекс. Хотя роданид кобальта является менее прочным комплексным соединением, чем роданид железа, тем не менее влияние последнего полностью устраняется, поскольку комплекс Fe3 с маскирующим реактивом ( фторид-ионом) прочнее роданида железа, а роданид кобальта, наоборот, прочнее комплекса фторида кобальта. [10]
Влияние посторонних ионов устраняют путем связывания их соответствующим реактивом в бесцветный комплекс. Относительная прочность окрашенных соединений определяемого и мешающего ионов здесь существенного значения не имеет, поскольку дополнительный маскирующий реактив выбирается таким образом, что от его введения окрашенный комплекс Ммеш К постороннего иона Ммеш разрушается, в то время как окрашенное соединение МН определяемого иона М остается без изменений. Для этого необходимо, чтобы прочность комплекса постороннего иона с маскирующим реактивом была больше, чем прочность комплекса его с рабочим реактивом. Так определяют, например, ионы кобальта роданидным методом в присутствии ионов железа. В качестве маскирующего реактива используют раствор фторид-ионов, которые связывают Fe3 1 в бесцветный фторидный комплекс. [11]
Через 10 мин смесь заменяют тем же объемом 66 % - ного этанола комнатной температуры и эту процедуру повторяют 3 раза в течение часа. Затем каждый квадратик бумаги помещают на 5 мин в ацетон, сушат кюд лампой в течение 10 мин, измельчают ножницами и помещают в пробирку, в которую приливают 0 9 мл 0 1 М ацетатного буфера ( рН 4 8) и 0 1 мл раствора глюкоами-лазы. Пробы перемешивают и инкубируют в течение 3 ч при 30 С. В качестве контроля используют пробу, содержащую измельченный квадратик чистой фильтровальной бумаги такого же размера. По окончании инкубации к каждой пробе приливают по 3 мл рабочего реактива для определения образовавшейся глюкозы глюкозооксидазным методом. [12]
Количество глюкозы в опытных пробах рассчитывают по калибровочному графику. Ввиду того что сернокислый цинк и щелочь частично ингибируют глюкозооксидазу, пробы со стандартным раствором глюкозы обрабатывают так же, как и опытные. Объем проб доводят дистиллированной водой до 3 мл, в контрольную пробу ( без глюкозы) вносят 3 мл дистиллированной воды. Осадок гидроокиси цинка удаляют центрифугированием или фильтрованием. Из каждой пробы отбирают по 0 5 мл раствора в чистые и сухие пробирки, приливают по 0 5 мл дистиллированной воды и по 3 мл рабочего реактива, перемешивают и фотометрируют развившуюся синюю окраску при 630 нм. [13]