Cтраница 1
Фракционируемые вещества всегда должны нести на себе некий электрический заряд или по крайней мере обладать способностью к ионизации. [1]
Если концентрацию фракционируемых веществ не удается определить спектрофотометрически, то полученные фракции можно подвергнуть щелочному гидролизу и проанализировать с помощью нингидриновой реакции ( см. стр. [2]
Этот выбор определяется степенью гидрофобности фракционируемых веществ. Поскольку предварительно оценить ее количественным образом невозможно, приходится идти по пути эмпирического подбора оптимальных условий хроматографии. Экспериментально такому значению К, как нам известно из гл. Будем иметь в виду, что гидрофобность матриц убывает в следующем ряду типов: RP-18, RP-8, RP-2, а гидрофобность органических растворителей - в ряду ТГФ - ацетонитрил - пропанол-метанол. [3]
Подробно различные варианты связывания молекул фракционируемых веществ внутри неподвижной фазы рассмотрены ниже, при описании соответствующих методов хроматографии. Сейчас достаточно отметить три общих для всех вариантов обстоятельства. Во-вторых, диффузия молекул от подвижной фазы к неподвижной п обратно протекает свободно и ( благодаря малым размерам гранул) на относительно небольших расстояниях. В-третьих, для каждого вещества имеет место определенное соотношение между степенями его сродства к подвижной и неподвижной фазам системы. [4]
Теоретически подача водяного пара или газа при вакуумной перегонке снижает парциальное давление фракционируемого вещества и тем самым понижает температуру его кипения. [5]
Выше мы молчаливо предполагали, что условия распределения и значения К остаются неизменными для каждой зоны фракционируемых веществ в течение всего их движения вдоль колонки. Для этого достаточно, чтобы распределение вещества между фазами подчинялось закону линейной изотермы, а состав и температура элюен-та не изменялись в ходе алюцгш до самого ее конца. Такой процесс именуется изократической элюцней. [6]
Акриламидные гели обладают низкой адсорбционной способностью, поэтому при равной разрешающей способности для них характерен больший выход фракционируемого вещества, чем для гелей декстрана. [7]
Разделение соединений по их молекулярным весам будет проходить в том случае, если злюирующий растворитель обладает в отношении вещества геля достаточным сродством, чтобы компоненты фракционируемого вещества не распределялись между двумя фазами в соответствии с растворимостями в этих фазах. Растворитель, следовательно, должен быть весьма близким по растворяющей способности к веществу геля. Более того, растворитель должен быть стабильным, растворять образец, способствовать, а не мешать работе системы детектирования растворенного вещества и допускать возможно более легкое выделение образца из отобранных фракций. [8]
Использование элюции градиентом концентрации одного из перечисленных десорбирующих агентов улучшает качество фракционирования за счет сужения зон элюции ( см. гл. Крутизна градиента ( объем элюции) выбирается эмпирически - по характеру разрешения зон фракционируемых веществ или отделения зоны вещества от примесей. [9]
Равновесия адсорбции, первоначально очень сильно сдвинутые в сторону образования комплексов, могут измениться таким образом, что фракционируемые вещества начинают мигрировать по колонке с различной скоростью, что характерно для процесса динамической хроматографии. [10]
В этом виде хроматографии неподвижная фаза представлена твердой поверхностью снаружи и внутри гранул сорбента - в их порах. Для пористых сорбентов, как и в случае гидрофобной хроматографии, имеет место эффект гель-фильтрации, поскольку жидкость внутри пор неподвижна, но по сравнению с адсорбцией этот эффект невелик и мы его опять учитывать не будем. На поверхности сорбента, вообще говоря, могут сорбироваться не только молекулы фракционируемого вещества, но и молекулы элюента, которые могут даже конкурировать с веществом за одни и те же участки поверхности. Однако обычно молекулы вещества обладают намного большим сродством к сорбенту, чем элюент, и такая конкуренция играет второстепенную роль. Равновесное распределение вещества между неподвижной и подвижной фазами определяется процессами его сорбции и десорбции на поверхности сорбента, которые в немалой степени зависят от природы элюента, но не столько в плане конкуренции за центры сорбции на поверхности, сколько в том смысле, что от характера элюента зависит растворимость вещества в жидкости подвижной фазы. [11]
Предварительное фракционирование с помощью полиакрила-мидного геля дает такие же результаты, как и гель-фильтрация на сефадексе. В отличие от природного декстранового геля, каким является сефадекс, полиакриламидный гель представляет собой гель синтетического полимера, обладающий чрезвычайно малыми абсорбционными свойствами. Поэтому разделение на полиакрила-мидном геле можно провести практически без потерь фракционируемого материала. Молекулярный вес фракционируемых веществ также очень существен для разделения на полиакриламидном геле. Чем ниже молекулярный вес компонентов разделяемой смеси, тем меньше индекс биогеля, который целесообразно использовать для фракционирования. [12]
Если электрофорез и хроматографию на бумаге можно отнести к микропрепаративным методам, то метод разделения смеси пептидов с помощью ионообменной хроматографии следует, пожалуй, считать макропрепаративным. Его главное преимущество заключается в том, что он позволяет обрабатывать большие количества материала и получать несомненно большие выходы фракций. Большим достижением в области ионообменной хроматографии является введение сферических смол. Их применение способствует увеличению скорости потока фракционируемых веществ через колонку и значительно сокращает продолжительность препаративного разделения. [13]
Важное преимущество методов препаративного фракционирования заключается в получении значительных количеств фракций, которые могут быть подробно исследованы и переработаны в опытные изделия. Все же подобные методы фракционирования обладают существенным недостатком - это, как правило, большая трудоемкость и длительность получения фракций. Обычно методы препаративного фракционирования можно использовать лишь для решения основных задач и нельзя применить при исследовании большего количества образцов, в частности, для контроля производственных процессов. Кроме того, эти методы подразумевают применение относительно больших количеств фракционируемого вещества. Это обстоятельство, хотя и не очень существенное для большинства технических полимеров, не позволяет воспользоваться препаративными методами для решения многих проблем физиологии, когда исследованию в ряде случаев можно подвергнуть лишь доли миллиграмма вещества. Часто также оказывается невозможным определить степень гомогенности фракций, полученных препаративными методами. [14]
Денатурация большинства белков приводит к увеличению гидрофобности их поверхности за счет экспонирования ранее недоступных для растворителя остатков гидрофобных аминокислот. Нуклеози-ды, а тем более нуклеотиды и нуклеиновые кислоты более гидрофильны за счет остатков Сахаров и ( особенно) фосфорной кислоты. Общеизвестно, например, что цетавлон осаждает нуклеиновые кислоты из водных растворов. Вообще следует иметь в виду, что внесением в жидкую фазу денатурирующих агентов, ионов, детергентов и других добавок можно изменять степень гидрофобности или гидрофилыюсти фракционируемых веществ как за счет упомянутой блокировки соответствующих функций, так и за счет изменения третичной структуры биополимеров в результате их денатурации. Ионные добавки могут изменять и свойства самого растворителя, например связывать воду, чем обусловлен известный эффект уменьшения растворимости белков в крепких солевых растворах - высаливание. Ряд катионов проявляет так называемый хаотронный эффект - они разрушают упорядоченную структуру воды, что приводит к ослаблению гидрофобных взаимодействий находящихся в водном окружении молекул. Из этого ряда наиболее интересен Li ввиду высокой растворимости его солей в воде. Существенную роль в нейтрализации гидрофильных заряженных групп вещества может играть изменение рН жидкой фазы. Таким образом, имеется обширный арсенал средств управления как степенью гидрофобности или гидрофилъности вещества, так и полярностью, а следовательно, и растворяющей способностью элюепта или жидкости неподвижной фазы. Это открывает разнообразные возможности для осуществления распределительной хроматографии. [15]