Селективная среда
Cтраница 2
При этом обращает на себя внимание существенное расхождение между опытными и расчетными значениями параметра температурного поля топки М для природного газа. Это расхождение связано с недостаточной точностью расчета по методу [56 ] теплообмена в топках для такой существенно селективной среды, как чисто газовый факел. [16]
Если добавить к почве тонко измельченный хитин, то в первую очередь реагируют на это быстрым размножением актиномицеты. Поэтому агаризованные среды, в которых хитин служит единственным источником углерода и азота, служат превосходными селективными средами для стрептомицетов. [17]
Их, как и картофельный агар с глюкозой, используют для выделения грибов из стерильных материалов ( крови, ликвора, биоптатов и т.п.) и инкубирование ведут более длительное время. Для приготовления селективных сред к неселективным добавляют антибиотики ( левомицетин - 20 - 50, стрептомицин - 40, пенициллин - 20 мкг / мл и др.), а также красители ( бенгальский розовый и др.) или дезинфектанты. Так, для выделения грибов из контаминированных бактериями материалов используют агар Са-буро с глюкозой, в который добавляют пенициллин и гейтами - цин или гентамицин и хлорамфеникол. [18]
Для инактивации чумного фага на поверхность среды наносят и равномерно распределяют 0 1 мл антифаговой сыворотки. Чтобы подавить рост посторонней микрофлоры в исследуемом материале, к 100 мл МПА добавляют 1 мл 0 1 % - го раствора генцианового фиолетового и 2 5 % сульфита натрия. С этой целью применяют также селективную среду с антибиотиками - агар CLN. Посевы инкубируют при 25 - 28 С. [19]
После 5-минутного встряхивания полученную суспензию раститровывали в чашки Петри на селективные среды для получения колоний микроорганизмов ( бактерий, грибов), которые визуально подсчитывали на 3 - й ( бактерии) и 5 - е ( грибы) сутки их роста в термостате при температуре 32 С и 26 С соответственно. [20]
Мочу для выделения уринокультуры асептически берут в конце лихорадочного периода катетером и центрифугируют. Из осадка делают посевы в чашки с печеночным агаром, содержащим ген-циановый фиолетовый в разведении 1: 200 000 для подавления роста грамположительной микрофлоры. Уринокультуры удается выделить в 9 - 14 % случаев. Применяют и другие селективные среды. [21]
Моноканальные антитела получают простым и весьма остроумным способом, обеспечивающим использование исключительно гибридных клеток. Мышей иммунизируют тем антигеном, получение антител к которому является конечной целью работы. Выделенные В-лимфоциты в присутствии полиэтиленгликоля ассоциируют с клетками миеломы, в результате чего происходит их слияние. Отбору гибридом способствует использование селективной среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Миеломные клетки на этой среде погибают из-за отсутствия в них ГГФРТ. Нормальные клетки имеют этот фермент, но также погибают, так как они не способны размножаться в культуре. В результате выживают только гибридные клетки. [22]
Метод фильтрации основан на способности подвижных кампилобактеров активно проходить через мембраные фильтры с порами диаметром 0 45 - 0 65 мкм. Фильтр укладывают на поверхность плотной среды в чашке, наносят на него 10 - 15 капель суспензии фекалий и инкубируют чашку при 37 С в течение 1 ч, после чего фильтр осторожно снимают, а чашку продолжают инкубировать в микроаэрофильных условиях. Проникшие через фильтр клетки кампилобактеров образуют на поверхности среды колонии. Чувствительность метода невысока ( около 105 КОЕ / мл), поэтому его рекомендуют сочетать с посевом на селективные среды или другими методами исследования. [23]
Сходные системы были найдены в группе псевдомонад. Конъюгация у энтеробактерий представляет собой высокоразвитый процесс; чтобы она осуществилась, достаточно суспендировать смесь клетою-партнеров в жидкой среде и оставить на некоторое время в покое. У многих других бактерий конъюгацию удается вызвать лишь в том случае, если колонии обоих партнеров будут хорошо перемешаны и размазаны на твердой среде, где они должны затем расти несколько дней. Если теперь распределить клетки по одной на селективной среде, то окажется, что у многих клеток возникла новая комбинация признаков и, по всей вероятности, произошел обмен крупными участками бактериальных хромосом. Процессы конъюгации широко изучались на Streptomyces coelicolor, видах Nocardia, Rhizobium и других бактериях. Обмен генами путем конъюгации и мобилизация генов с помощью плазмид, вероятно, очень распространены в мире прокариот. [24]
Клетки лимфоузла ( чаще всего селезенки), иммунизированного определенным антигеном животного, сливаются в присутствии поли эти лент л и коля с миеломными клетками. Такая гибридизация приводит к образованию клеток, унаследовавших от одной из родительских клеток ( плазматической клетки) способность секретиро-вать антитела, а от другой ( миеломной) - способность к бесконечному делению. Ключевым моментом является отбор гибридных клеток, отделение от родительских клеток. Если блокировать и основной путь биосинтеза пуринов и пиримидиновс помощью аминоптерина, то такие мутанты оказываются нежизнеспособными и погибают. Гибридные же клетки, имеющие от второй родительской клетки гены ГФТ и ТК, способны к размножению в присутствии аминоптерина; таким образом, культивируя клетки после слияния на селективной среде ( содержащей аминоптерин), удается добиться избирательного роста популяции гибридных клеток. Рассеивая гибридные клетки по лункам иммунологического планшета, добиваются того, чтобы в лунке оказался лишь один клеточный клон, отбираются клоны, секрети-рующие антитела нужной специфичности ( для чего проверяется наличие соответствующих антител в культуральной среде), а затем наращиваются гибридные клетки в больших количествах in vitro или in vivo в виде асцитов у животных. Такая технология позволяет нарабатывать значительные количества так называемых монокло-нальных ( продуктов одного клона) гомогенных антител. [25]
 |
Схема получения трансгенных мышей. [26] |
Внедрение вирусов в животные клетки является ярким примером генетической трансформации последних в природных условиях. Ениш встроил в геном мыши чужеродные гены, передававшиеся по наследству. Схема проведения генно-инженерных процедур подобна таковым для микробных и растительных клеток, однако в связи со сложностью структур животных клеток имеются некоторые особенности. Для клонирования генов животных используют векторы на основе вирусной ДНК, чаще всего вируса SV-40. Часть генома этого вируса удаляется, а вместо него встраиваются гены, которые необходимо ввести в животную клетку. Отбор трансформированных клеток проводят с помощью точечного мутагенеза и селективных сред. Если клетки с мутациями по данным ферментам поместить на среду, содержащую гипоксантин, аминопте-рин и тимидин ( ГАТ-среду), то они на ней расти не будут, в отличие от клеток, содержащих вектор с этими генами. [27]
Смешивают суспензии клеток миеломы и селезенки в соотношении 1: 10 и центрифугируют в течение 8 мин при 800 об / мин. Осадок встряхивают и по каплям добавляют 1 мл 50 % - ного раствора ПЭГ с ДМСО в течение 1 мин при постоянном встряхивании пробирки. Клетки центрифугируют в следующем режиме: разгоняют центрифугу до 1000 об / мин и тут же выключают. После остановки центрифуги вынимают пробирку с осевшими клетками и суспендируют клетки встряхиванием в том же растворе ПЭГ. К суспензии клеток добавляют по каплям 1 мл бессывороточной среды в течение 1 мин, затем каждую последующую минуту удваивают объем, добавляя 2, 4, 8 и 16 мл соответственно при постоянном встряхивании пробирки до конечного объема 32 мл. Клетки центрифугируют в обычном режиме в течение 8 мин при 800 об / мин. Супернатант отбрасывают, клетки суспендируют в селективной среде ГАТ в концентрации 105 - 5 - Ю5 клеток в 1 мл. [28]
При бактериологической диагностике коклюша и паракоклюша производят посев мокроты методом кашлевых пластинок. Для этого в момент приступа кашля перед ртом больного на расстоянии 8 - 12 см помещают открытую чашку Петри с питательной средой ( картофельно-гли-цериновый агар по Борде, молочно-кровяной или казеиново-угольный агар) и выдерживают в течение 6 - 8 кашлевых толчков. Чашку закрывают и помещают в термостат при 37 С. Если кашель отсутствует, отделяемое слизистой оболочки с задней стенки глотки собирают клювовидным тампоном через рот или тампоном через нижние носовые ходы и сеют на чашки с указанными выше питательными средами. Следует учитывать также, что на сухом ватном тампоне бордетеллы быстро отмирают в результате высушивания и действия токсичных для них компонентов ваты. Если нет возможности немедленно посеять материал, его берут тампоном, смоченным в ИХН. Материал доставляют в лабораторию как можно быстрее и засевают на селективные среды в течение 2 ч после взятия. При посеве взятый тампоном материал тщательно растирают по поверхности агара ( от периферии к центру чашки) для получения хорошо изолированных колоний. [29]
Страницы: 1 2