Фермент - рестрикция
Cтраница 1
Ферменты рестрикции ( рестриктазы) - ферменты, выделенные из бактерий. ДНК на фрагменты, которые используются в генной инженерии. [1]
Ферменты рестрикции ( рестриктазы) - ферменты, выделенные из бактерий. Способны расщеплять любую ДНК на фрагменты, которые используются в генной инженерии. [2]
Для выделения генов, кодирующих ферменты рестрикции и модификации ( метилирования), можно использовать также другой подход, который состоит в следующем. [3]
Если в хозяйской клетке экспрес-сируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа А. ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [4]
Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первых, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Этот фермент катализирует образование фосфо-диэфирных связей между концами полинуклео-тидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. [6]
Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эн-донуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эн-донуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы. [7]
Метод иллюстрируется здесь ссылкой на один из трех синтезов самокомплиментарных декамерных фрагментов ДНК, которые, в форме дуплексов, являются субстратами для расщепления ферментами рестрикции [7] ( см. разд. Динуклеотид dCpCp защищен с помощью 4-хлорфенола по фосфатным группам, бензоильными остатками - по основаниям и диметокситрити-лированием-по 5 -гидроксильной группе. Затем эти пентамеры сшивают, что приводит к декамерному соединению, которое после удаления всех защитных групп аммиакатом пиридиния и последующей мягкой кислотной обработки было очищено тонкослойной хроматографией на целлюлозе. [8]
Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов - обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса. Речь идет прежде всего о ферментах рестрикции ( ре-стрицирующих эндонуклеазах, рестриктазах), которые узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепо-чечной молекуле ДНК. [9]
Синтетические декамерные дуплексы такого рода предназначены для присоединения встык к генам ДНК, полученным химически или ферментативно путем связывания лигазами. Когда они затем подвергаются зависимому от последовательности эндонук-леазному действию фермента рестрикции ( см. разд. Поскольку идентичные липкие концы могут быть получены в результате действия того же фермента рестрикции на бактериальную хромосому, то может быть создана возможность для введения искусственного гена в хромосому ( см. разд. [10]
Оба метода используют авторадиографическое определение 32Р - меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в по-лиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. [11]
Синтетические декамерные дуплексы такого рода предназначены для присоединения встык к генам ДНК, полученным химически или ферментативно путем связывания лигазами. Когда они затем подвергаются зависимому от последовательности эндонук-леазному действию фермента рестрикции ( см. разд. Поскольку идентичные липкие концы могут быть получены в результате действия того же фермента рестрикции на бактериальную хромосому, то может быть создана возможность для введения искусственного гена в хромосому ( см. разд. [12]
Недостаточно обоснованные выводы о встречаемости нуклеозидов могут оказаться некорректными. Так, помимо восьми основных нуклеозидов ( 1) - ( 8), большинство классов нуклеиновых кислот, столь сильно различающихся между собой, содержат, как было показано, в большем или меньшем процентном отношении модифицированные нуклеозиды. Длительное время было известно, что 5-метилдезоксицитидин образуется в гидролизатах ДНК растений и животных [7]; полагают, что каждая система ферментов рестрикции бактерий содержит метилазу, которая метилирует специфические остатки оснований ДНК хозяина в последовательности, узнаваемой рестрикционной эндонуклеазой [7], давая таким образом появление модифицированных нуклеозидов из бактериальной ДНК. [13]
Это связано прежде всего с обнаружением ферментов, способных специфически расщеплять цепь ДНК. Один из этих ферментов - эндонуклеаза IV, индуцируемая фагом Т 4; она расщепляет денатурированную или одноцепочечную ДНК с образованием фрагментов, содержащих dpC на 5 -конце, причем преимущественно рвутся связи между остатками дезокситимидина и дезоксицитидина. Варьируя условия гидролиза, удается регулировать степень его протекания и таким образом получать фрагменты различной длины. Наиболее радужные перспективы в отношении выяснения первичной структуры ДНК связаны со все более расширяющимися исследованиями по выделению ферментов рестрикции. [14]
Страницы: 1