Ионообменная хроматография - белок
Cтраница 1
 |
Хроматограмма смеси пепсина и пепсиногена. [1] |
Ионообменная хроматография белков при всех своих достоинствах обладает и серьезными недостатками. Многие белки неполностью элюируются с ионообменника, что ведет иногда к существенным потерям. Ряд лабильных белков денатурируется при взаимодействии с ионообменником, как полагают, в результате взаимодействия углеводородных радикалов с матрицей ионообменника и развертывания пептидных цепей, составляющих белковую молекулу. Поэтому наилучшие результаты дает обычно хроматографическое разделение относительно устойчивых низкомолекулярных белков. [2]
Ионообменную хроматографию белков [20] выполняют на ионообменниках, имеющих гидрофильную матрицу, например на целлюлозе и декстране. Анионообменники, особенно DEAE-целлюлозу и DEAE-сефадекс, используют чаще, чем катионооб-менники типа СМ-целлюлозы. Ионообменники на основе целлюлозы имеют открытую сетчатую структуру с ионизованными центрами, легкодоступными для белков. Число ионных связей, образующихся между обменником и белком, зависит не только рт используемого материала, но также в большой степени от рН и ионной силы буфера. Эти ионные пары постоянно диссоциируют и образуются вновь, так как ионы элюента конкурируют за центры обмена. Обменники, пригодные для фракционирования белков, имеют низкую плотность зарядов, поэтому число ионных связей между ионитом и отдельными молекулами белка не столь велико, чтобы вообще воспрепятствовать продвижению последних вдоль колонки. Хотя ионные связи постоянно диссоциируют и образуются вновь, в начале хроматографирования белок связывается с ионообменником и не элюируется с колонки. Однако когда концентрация небольших конкурирующих ионов буфера возрастает до такого уровня, что все связи одновременно разрываются, белок начинает двигаться вниз по колонке. Если в процессе разделения используют градиент ионной силы, белок, перемещающийся в стартовой зоне медленнее, чем буфер, элюируется им при увеличении концентрации ионов. Таким образом, элюирующая способность буферного раствора постоянно увеличивается и макромолекула перемещается все быстрее и быстрее. Скорость ее перемещения становится сравнимой со скоростью движения жидкости, когда в элюенте достигается такая концентрация соли, которая эффективно препятствует взаимодействию молекулы белка с обменником. Важное значение в каждом отдельном случае имеет профиль градиента: чтобы увеличить разрешение пиков в определенных участках хромато-граммы, используемый градиент должен быть сравнительно пологим, но в то же время достаточно крутым в других участках, чтобы избежать уширения пиков. [3]
Метод ионообменной хроматографии белков с использованием ионитов на целлюлозной основе был предложен Петерсоном и Соберем. Целлюлозоиониты синтезируют путем химической модификации целлюлозы; они имеют высокую емкость для белков и могут быть получены с любой желаемой ионообменной характеристикой. [4]
Эта область ионообменной хроматографии белков наиболее обширна. Сделаем попытку систематизации используемых здесь приемов, разделив их на шесть групп. [5]
 |
Список ряда работ, посвященных хроматографии пептидов. [6] |
В настоящее время в ионообменной хроматографии белков и ферментов применяются почти исключительно эти производные. Структура матриц этих ионов такова, что в нее легко проникают даже крупные макромолекулы, благодаря чему в ионном обмене участвуют группы, расположенные внутри зерен ионита. В ряде статей и монографий ( некоторые из них указаны в табл. 5.13) описаны методы сорбции на ионитах и методы хроматографии белков. В большинстве случаев для хроматографии белков применяют DEAE-целлюлозу. [7]
Ранее в этой главе мы описали выдающиеся достижения фирмы Pharmacia в разработке ионообменников нового типа, с появлением которых, по-видимому, начинается новый этап развития ионообменной хроматографии белков и пептидов при умеренных давлениях. [9]
Ионообменная хроматография на колонках с ионитами основана на обмене ионов данного вещества с подвижными ионами ионита. Для ионообменной хроматографии белков и других биологических веществ применяются синтетические ионообменные смолы и иониты на целлюлозной основе - целлюлозоиониты. [10]
Это вызвано тем, что белки либо прочно сорбируются на ионообменнике, либо выходят с элюи-рующим буферным раствором, поскольку происходит одновременная взаимная нейтрализация многочисленных реакций взаимодействия между белком и ионообменником при данных рН и ионной силе раствора. Поэтому важно тщательно подбирать буферный раствор для ионообменной хроматографии белка. Ионообменную колонку обычно загружают при низкой ионной силе раствора. [11]
Основу руководства составили работы, которые на протяжении ряда лет используются в учебном процессе на кафедре биохимии 1 ММИ им. В практикум включены работы, знакомящие студентов с современными методами исследования и проблемами биохимии, такими, как электрофорез белков в полиакрила-мидном геле, ионообменная хроматография белков, гель-фильтрация, изучение четвертичной структуры белков и др. Подобраны и приспособлены к условиям работы в студенческой лаборатории современные методы выделения и изучения ферментов, их количественного определения в биологических жидкостях и тканях. Авторы стремились по возможности использовать в качестве объектов изучения биологические материалы, с которыми обычно имеет дело клиническая биохимия. [12]
Уже давно для очистки белков и их разделения применяли методы, основанные на неодинаковом сродстве белков к некоторым адсорбентам. Однако наибольшее развитие и практическое применение получила ионообменная хроматография белков, которая и будет здесь рассмотрена. [13]
Страницы: 1