Cтраница 1
Ковалентная хроматография, как говорит само название, предполагает образование ковалентной химической связи между лиган-дом и веществом, подлежащим хроматографической очистке. Поэтому отнести этот метод к категории аффинной хроматографии можно лишь условно. Такое отнесение оправдывается двумя обстоятельствами. Во-первых, этот весьма общий ( и потому не очень удачный, но уже укоренившийся) термин на самом деле подразумевает образование лишь двух типов ковалентной связи между лигандом и веществом: S-S и S-Hg, так что выделение ковалентной хроматографии в отдельную главу не оправдано. Во-вторых, необходимым условием для возникновения таких связей, очевидно, является наличие на ли-ганде и веществе свободных тиогрупп ( - SH), способных образовать мостик S-S, или SH-группы и атома двухвалентной ртути, например в составе радикала - HgCl. В этом смысле можно говорить о необходимости определенного рода сродства между лигандом и веществом, которое, разумеется, не является строгим: один и тот же несущий SH-группу лиганд может связывать самые разнообразные белки, модифицированные нуклеиновые кислоты и низкомолекулярные соединения, если в них есть необходимый радикал. [1]
Ковалентная хроматография ограничивается образованием двух видов связей с участием серы ввиду того, что эти связи лабильны - могут быть образованы, а затем разрушены в ходе окислительных и восстановительных реакций, идущих в мягких условиях, что позволяет сохранять нативность сорбируемых веществ. Лабильность связей, очевидно, является необходимым условием любого хроматогра-фического процесса. [2]
Ковалентная хроматография основана на ковалентном связывании поглощаемого вещества. [3]
Другой пример ковалентной хроматографии, а именно тиолди-сульфидный обмен, применяемый для выделения белков и пептидов со свободными SH-группами, уже рассмотрен в разд. [4]
Применение тиоловых сорбентов для ковалентной хроматографии нуклеиновых кислот базируется на возможности получения их ртутных производных. Такие производные можно получать двумя способами. [5]
В числе аффинных сорбентов, выпускаемых той же фирмой, есть еще один, предназначенный также для ковалентной хроматографии. В отличие от всех предыдущих он па конце довольно длинного спейсера несет атом ртути, охотно связывающий меркаптосоединения. [6]
Выделение пептидов с остатками цистеина на ртутьсодержа-щих адсорбентах осуществляется благодаря образованию кова-лентных связей и на этом основании может рассматриваться как первый пример ковалентной хроматографии. [7]
Между выделяемым белком и нерастворимым носителем образуется ковалентная связь, которая после отмывки несортированного материала расщепляется под действием избытка низкомолекулярного тиола RSH. Поскольку имеет место образование ковалент-ной связи, этот тип хроматографии называется ковалентной хроматографией и рассмотрен в разд. [8]
Специфические сорбенты, использующие исключительные свойства биологически активных веществ образовывать специфические и обратимые комплексы, в огромной степени облегчают выделение ряда ферментов, их ингибиторов и кофакторов, антител и антигенов, лектинов, гликопротеинов, гликополисахаридов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, жиров, транспортных и рецепторных белков, гормонов и их рецепторов, клеток и многих других соединений, как это представлено в обзорной табл. 11.1. Наряду с названием выделяемого вещества в таблице приведены также используемые аффинные лиганды, нерастворимые носители и пространственные труппы, причем указано, аффинный лиганд или нерастворимая матрица модифицированы данной пространственной группой. Обзорная таблица включает выделения веществ как с помощью типичной биоаффинной хроматографии, так и с помощью гидрофобной или ковалентной хроматографии. [9]
Приведенный перечень наиболее часто употребляемых продажных лигандов с групповой специфичностью, которые нам казалось необходимым хотя бы вкратце охарактеризовать, далеко не исчерпывает всего их многообразия. Сюда не вошли, например, аминокислоты, различные сахара и аминосахара, производные холевой кислоты, спермин, протамин, гистон, биотин и авидин, ингибиторы трипсина, апротинин, желатин и др. В этот перечень не были включены и тно-ловые сорбенты для ковалентной хроматографии, в которой используется образование временных связей между лигандом и веществом. Такие сорбенты будут рассмотрены отдельно. [10]
Часто перед исследователями встает задача селективного выделения из суммарного гидролизата белка пептидов, несущих определенные функциональные группы. Для этих целей может быть эффективно использована хемоспецифическая, или ко валентная, хроматография, основанная на образовании ко валентной связи пептида с носителем. Чаще всего метод ковалентной хроматографии применяют для селективного аыделения иистеинсодержащих пептидов. При этом пептиды, не содержащие остатков цистеина, не саязываются с носителем и удаляются при промывании соотаетстаующим буфером. Цистеинсодержащие пептиды выделяют далее восстановлением дисульфидных связей при рН 8 0 избытком меркаптоэтанола или дитиотреита. Более селективного разделения тиолсодержащих и тиолнесодержащих пептидов можно достигнуть, если проводить ферментативный или химический гидролиз белка, предварительно иммобилизованного иа нерастворимом носителе. В качестве носителя в обоих случаях используется тиол-сефароэа 4В, которая содержит в качестве активированной группы смешанный дисульфид, образующийся при обработке глу-татион-сефарозы 2 2 -дипиридилдисульфидом. [11]
Если аффинный лиганд присоединен к матрице с помощью азо-связи или сложноэфирными связями тиолов или спиртов, с нерастворимой матрицы можно снять комплекс аффинного лиганда с выделяемым веществом, а затем аффинный лиганд отделить диализом или гель-фильтрацией. Этот способ, однако, не позволяет повторно использовать аффинную матрицу. Носители такого типа детально обсуждены в разделе о ковалентной хроматографии ( разд. [12]
Ковалентная хроматография, как говорит само название, предполагает образование ковалентной химической связи между лиган-дом и веществом, подлежащим хроматографической очистке. Поэтому отнести этот метод к категории аффинной хроматографии можно лишь условно. Такое отнесение оправдывается двумя обстоятельствами. Во-первых, этот весьма общий ( и потому не очень удачный, но уже укоренившийся) термин на самом деле подразумевает образование лишь двух типов ковалентной связи между лигандом и веществом: S-S и S-Hg, так что выделение ковалентной хроматографии в отдельную главу не оправдано. Во-вторых, необходимым условием для возникновения таких связей, очевидно, является наличие на ли-ганде и веществе свободных тиогрупп ( - SH), способных образовать мостик S-S, или SH-группы и атома двухвалентной ртути, например в составе радикала - HgCl. В этом смысле можно говорить о необходимости определенного рода сродства между лигандом и веществом, которое, разумеется, не является строгим: один и тот же несущий SH-группу лиганд может связывать самые разнообразные белки, модифицированные нуклеиновые кислоты и низкомолекулярные соединения, если в них есть необходимый радикал. [13]
Далее будут приведены примеры аффинного фракционирования и очистки самих нуклеиновых кислот, в том числе на иммуносорбентах. Основное внимание уделим более простому и универсальному методу - неспецифической элюции, однако биоспецифическая аффинная элюция белков тоже будет представлена несколькими типичными примерами. Рассмотрение начнем с использования сорбентов с индивидуальной специфичностью, ограничившись здесь тремя примерами, поскольку нет смысла пытаться сколько-нибудь полно иллюстрировать бесчисленное разнообразие возможных сорбентов этого типа. Аффинная хроматография белков клеточного метаболизма на сорбентах с групповой специфичностью будет иллюстрирована подробнее, а затем последуют два примера использования ковалентной хроматографии. [14]