Cтраница 2
По гипотезе Филлипса, ион карбония стабилизируется в активном центре фермента путем электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка Asp 52 ( см. рис. 20), расположенной на расстоянии 3 А от положительно заряженного атома углерода C ( D. На этом реакция заканчивается, и гликоновый фрагмент субстрата диссоциирует из активного центра лизоцима. Агликоновый фрагмент субстрата к этому времени уже должен десорбироваться с участков Е и F ( и последующей части лизоцима справа от активного центра в случае более протяженных субстратов), чтобы обеспечить прохождение реакции трансгликозилирования, которая часто наблюдается в катализе лизоцимом. [16]
Несколько позже эти данные и расчеты серьезно пересматривались [89], и было показано, что лактонная концевая группа ( 153) связывается с участком D активного центра лизоцима лишь в 30 раз более эффективно, чем обычный N-ацетилглюкозаминный остаток. Однако в любом случае, взаимодействует ли лактон с ферментом прочно или нет, не имеет никакого отношения к напряжению или деформации субстрата в активном центре лизоцима. Даже если лактон и является аналогом переходного состояния в катализе лизоцимом, опыты по его связыванию с ферментом не могут дать никакого ответа на то, в какой форме - искаженной или обычной ( стабильной) - субстрат находится в комплексе Михаэлиса с ферментом. [17]
Эти данные принимались как поддержка гипотезы напряжения субстрата в участке D активного центра лизоцима в основном состоянии ( см. [88]), хотя ясно, что плохое связывание в активном центре не обязательно ведет к деформации субстрата, но может привести к ускорению ферментативного катализа при последующем более прочном связывании с активным центром в переходном состоянии реакции. [18]
Для установления роли данных ионогениых групп лизоцима в катализе и ( или) в поддержании каталитически активной кон-формации активного центра в работе [64] была изучена рН - зави-симость инактивации лизоцима под действием ультразвука. Как видно из рис. 22, группа с рК 5 0, контролирующая каталитическую активность лизоцима, не проявляется в рН - зависимости константы скорости инактивации фермента под действием ультразвука. Следовательно, протонирование этой группы не приводит к какому-либо существенному конформационному изменению в активном центре лизоцима, хотя и делает фермент каталитически неактивным. [19]
Однако результаты кинетического исследования гидролиза небольших субстратов свидетельствуют о том, что более предпочтительным является согласованный механизм с участием донора и акцептора протона или комбинированный механизм с участием донора протона и нуклеофила. Было установлено, что лизоцим способен катализировать реакцию трансгликозилиро-вания. Это свойство фермента легло в основу способа синтеза п-нитрофенил-р-ц - глюкозида и соответствующего олигомера. Поскольку лизоцим катализирует гидролиз гликозидных связей, вблизи которых ацетил аминогруппы отсутствуют, можно заключить, что анхимерное содействие со стороны N-ацетиламиногруппы не является непременным элементом механизма ферментативного расщепления гликозидных связей. Границы активного центра лизоцима точно не определены, однако ясно, что его размеры должны быть велики, поскольку фермент способен взаимодействовать с гексасахаридами, и, кроме того, кинетика реакции сильно зависит от длины сахаридного субстрата. Особенно убедительно выглядят данные, свидетельствующие об образовании оксокарбониевого иона и участии в катализе глутаминовой кислоты Glu-35. Сохранение конфигурации аномерного центра позволяет заключить, что если оксокар-бониевый ион возникает в ходе катализа, то его пространственное строение жестко фиксируется ферментом. [20]