Галактозидаз
Cтраница 3
Брожение большинства спиртных напитков осуществляется с помощью штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Это не означает, что дрожжи низового брожения не имеют собственных отличительных черт. Известно, что они могут вырабатывать галактозидазу и метаболизировать мелибиозу. [31]
Для клонирования в pUC19 донорную ДНК расщепляют одной из рестриктаз, чей сайт находится в полилинкере; плазмидную ДНК гидроли-зуют такой же рестриктазой, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой. Обе ДНК смешивают в присутствии ДНК-лигазы Т4 и используют образовавшийся продукт для трансформации клеток, которые могут синтезировать ту часть р-галактозидазы ( LacZa), которая соединяется с продуктом гена lacZ с образованием активного фермента. Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для Р - галактозидазы. Нетрансфоми-рованные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. [32]
Первый пример относится к хорошо изученному явлению синтеза в микробной клетке фермента - га-лактозидазы, который расщепляет лактозу ( молочный сахар), поглощаемую клеткой из окружающей среды. Когда в среде, окружающей клетку, нет лактозы, тогда клетке фермент галактозидаза не нужен, и репрессор, вырабатываемый цистроном-регулятором, взаимодействует с цистроном-оператором, запирая его. В результате этого структурные цистроны не вырабатывают информационной РНК, которая является матрицей для синтеза белка-фермента галактозидазы и последняя благодаря этому не синтезируется клеткой. Но как только в окружающей среде появляется лактоза, ее молекулы, проникая в клетку, взаимодействуют с репрессором и таким путем связывают, инактивируют его. Цистрон-оператор, освобождаясь от репрессора, способствует структурным цистронам синтезировать информационную РНК, и в рибосомах начинается синтез фермента галактозидазы. При этом цистрон-регулятор продолжает работать, образуя все новые и новые порции репрессора. Однако он весь связывается лактозой, и пока лактоза присутствует в среде, синтез галактозидазы происходит непрерывно. [33]
Клетка имеет широкие возможности для запуска производств различных клеток и белковых катализаторов. Относительно некоторых ферментов мы уже сейчас имеем сведения, сколько примерно молекул данного белка находится в одной клетке. Так, каждая клетка кишечной палочки, растущей в среде лактозы, имеет около 3000 молекул фермента галактозидазы, что составляет примерно 3 % от всего клеточного белка. [34]
Этот подход был использован при клонировании гена соматостатина-пт-тидного гормона ( 14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и гормона роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена ( 3-галактози-дазы. В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом Р - галактозидазы и соматостатина. Гибрид р-галактозидазы и соматостатина расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. [35]
Палмер [55] получили данные, подтверждающие существование: генетической регуляции временной катаболир: ной репрессии. Они сравнили поведение мутантов, конститутивных по отношении:) к р-галактозидазе, с поведением мутантов, которые продуцировали этот фермент как обычно, нуждаясь для этого в индукторе. Штамм называется конститутивным, если у него произошла мутация либо в гене-операторе, либо в гене-регуляторе. В принципе мутации в гене-регуляторе ( i -) могут приводить к образованию измененного репрессора ( БР на фиг. Такой мутант не нуждается в индукторе для синтеза Р - галактозидазы, Он является конститутивным: потому ч: х не может репрессировать синтез этого фермент а. Аналогично ведет себя мутант с дефектным оператором; в этом случае, несмотря на то что ген i синтезирует нормальный репрессор, последний не может связываться с дефектным оператором. [36]
Кинетика синтеза Р - галактозидазы клеткой своеобразна. Она подчиняется правилу все или ничего. Когда концентрация индуктора достаточно велика ( - 4 10 - 4М), немедленно срабатывает весь механизм. Сначала образуется пермеаза, она вызывает быстрый рост концентрации индуктора внутри клетки. Немедленно начинается усиленный синтез как самой пермеазы, так и Р - галактозидазы. Весь процесс разгоняется автоматически, и за время 2 - 3 мин. [37]
Первый пример относится к хорошо изученному явлению синтеза в микробной клетке фермента - га-лактозидазы, который расщепляет лактозу ( молочный сахар), поглощаемую клеткой из окружающей среды. Когда в среде, окружающей клетку, нет лактозы, тогда клетке фермент галактозидаза не нужен, и репрессор, вырабатываемый цистроном-регулятором, взаимодействует с цистроном-оператором, запирая его. В результате этого структурные цистроны не вырабатывают информационной РНК, которая является матрицей для синтеза белка-фермента галактозидазы и последняя благодаря этому не синтезируется клеткой. Но как только в окружающей среде появляется лактоза, ее молекулы, проникая в клетку, взаимодействуют с репрессором и таким путем связывают, инактивируют его. Цистрон-оператор, освобождаясь от репрессора, способствует структурным цистронам синтезировать информационную РНК, и в рибосомах начинается синтез фермента галактозидазы. При этом цистрон-регулятор продолжает работать, образуя все новые и новые порции репрессора. Однако он весь связывается лактозой, и пока лактоза присутствует в среде, синтез галактозидазы происходит непрерывно. [38]
ДНК - Согласно схеме процесса, разработанного Eli Lilly в сотрудничестве с фирмой Genenetech Inc. На б - конце каждого из них располагается кодон метиони-на ( который в синтезированном белке оказывается N-конце-вым), а на 3 -конце - терминирующие последовательности. Поскольку бактерии растят на среде с галактозой, а не с глюкозой, то в них индуцируется синтез jJ - галактозидазы, а вместе с ней - А - и В-цепей инсулина, присоединенных через остаток метиони-на. [39]
Здесь О обозначает ген-оператор, z - структурный ген Р - галактозидазы, у - ген галакто-зидпермеазы, ах - ген тиогалактозид-транс-ацетилазы. Следует упомянуть, что ген-регулятор i находится вне / ас-оперона. Первые данные о неправильности этой простой модели были получены И. Полученное им значение молекулярной массы позволило рассчитать, что помимо ферментов, синтезирующихся в одинаковых количествах, на одну молекулу трансацетилазы синтезируется 25 субъединиц Р - галактозидазы. [40]
Так как остаток глюкозы обладает свободным глюкозидным гидроксилом, возможна мутарация и существование лактозы в двух формах. Она входит в состав молока млекопитающих ( 5 - 8 %), яа дена также в пыльцевых трубочках ряда растений. Лактоза плохо растворима в воде, ее можно получить путем упаривания молочной сыворотки. При этом она кристаллизуется в виде моногидрата. Кристаллы лактозы не гигроскопичны. Под действием кислот и фермента лактазы ( Р - галактозидазы) она расщепляется на глюкозу я галактозу. Лактоза имеет важное биологическое значение в организме, ее широко используют в медицине и пищевой промышленности. [41]
 |
Получение соматостатина через гибридный белок с р-галактозидазой. [42] |
Иногда присоединение ведется таким образом, что кодирующая часть зукариотического гена присоединяется к кодирующей части бактериального гена так, чтобы сохранялась рамка считывания. В последнем случае образуются гибридные белки, содержащие в N-концевой части бактериальный белок или его часть, а в С-концевой части - эукариоти чес кий белок. Аминокислотная последовательность гормона известна, и исходя из нее, согласно генетическому коду, была выведена структура соответствующего искусственного гена. В результате такого соединения получен гибридный ген, в котором С-концевая часть геиа [ i-галактозидазы заменена геном соматостатина. Между геном р-галактозидазы и собственно геном соматостатина находится кодон метиоиииа. Транскрипция и трансляция этого гибрида осуществлялась за счет использования соответ-стаующих сигнальных последовательностей fi - галактозидазы. В результате образовался химерный белок, а котором соматостатин отделен от р-галактозидазной части остатком метионина. [43]
Страницы: 1 2 3