Атфазная активность - миозин
Cтраница 1
АТФазная активность миозина открыта акад. [1]
АТФазной активности миозина, несмотря на то, что в пробах выпадают хлопья белка, что визуально воспринимается как денатурация. Наименьшее активирующее действие проявляется в случае толуола - неполярного соединения. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что гидрофобные взаимодействия в молекуле миозина могут участвовать не только в поддержании определенной пространственной структуры белка, но и в регуляции его активности. [2]
Сравнивается АТФазная активность миозина в двух рядах проб. В первом ряду порядок смешивания растворов следующий: сначала к раствору миозина добавляется раствор ПХМБ, а после взаимодействия белка с модификатором, продолжающегося в течение 5 мин, добавляется инкубационная среда, содержащая АТФ. [3]
Постановка эксперимента полностью идентична вышеописанной, при этом сопоставляют действие ПХМБ, ионов серебра ( 5 - 10 - 4 М р-р - AgCl2) и ионов двухвалентной ртути ( 5 - 10 - 4 М раствор HgCU) на АТФазную активность миозина. ПХМБ, по-видимому, обусловлена взаимодействием его слабополярной органической части с гидрофобными группами белка); б) для полного блокирования АТФаз-ной активности требуется такое же количество ионов серебра, как и количество ПХМБ, но вдвое меньшее количество двухвалентной ртути, что говорит в пользу попарно сближенного расположения сульфгид-рильных групп в молекуле миозина. [4]
На примере миозиновой АТФазы рассматривается случай химической модификации с помощью некоторых сульфгидрильных реагентов, доказывается участие SH-групп в регуляции активности миозина ( SH-группы непосредственно в активный центр этого фермента не входят), а также устанавливается важная роль гидрофобных взаимодействий в осуществлении регуляторного влияния на АТФазную активность миозина. Демонстрируется также стабилизирующее действие АТФ на структуру активного центра миозина. [5]
ПХМБ, а затем реакцию начинают, добавляя в каждую пробирку по 1 4 мл раствора миозина. Одновременно следует удостовериться, что при взаимодействии с АТФ АТФазная активность миозина даже в присутствии ПХМБ стабильна и не меняется за все время проведения АТФазной реакции. Для этого в отдельном эксперименте определяют зависимость нарастания неорганического фосфата от времени в присутствии количеств ПХМБ, достаточных для 50 - 70 % - ной модификации белка. [6]
 |
Строение толстого миозинового филамента. [7] |
Актомиозин образуется при соединении миозина с F-актином. Ак-томиозин, как естественный, так и искусственный, т.е. полученный путем соединения in vitro высокоочищенных препаратов миозина и F-актина, обладает АТФазной активностью, которая отличается от таковой миозина, АТФазная активность миозина значительно возрастает в присутствии стехиометрических количеств F-актина. Фермент актомиозин активируется ионами Mg2 и ингибируется этилендиаминтетраацетатом ( ЭДТА) и высокой концентрацией АТФ, тогда как миозиновая АТФаза ингибируется ионами Mg2, активируется ЭДТА и не ингибируется высокой концентрацией АТФ. Оптимальные значения рН для обоих ферментов также различны. [8]
Молекула миозина сильно вытянута в длину, причем ее длинная, стержневая часть образована двумя тяжелыми полипептидными цепями, которые на этом участке имеют структуру а-спирали и к тому же закручены одна вокруг другой в суперспираль. N-концы тяжелых цепей образуют глобулярные головки, каждая из которых находится в комплексе с двумя легкими цепями. АТФазная активность миозина сосредоточена в головках, имеющих каждая по одному активному центру. Да, лишенный большей части стержня, или хвоста, миозино-вой молекулы, а также препараты головок. Электрофоретическая картина зависит от вида примененной протеазы, ее концентрации и времени обработки белка. Головки, или, как их называют, субфрагмент-1, полученный путем химиотрипсинового протеолиза, при ДСН-элект-рофорезе дают полосу 96 000 Да - - фрагмент тяжелой цепи, и две полосы легких цепей - примерно 18 000 и 15 000 Да. Две другие легкие цепи отсутствуют вследствие деградации. Тяжелый меромиозин обычно дает целый набор полос, среди которых присутствуют: 81 000 Да, 74 000, 51 000, 37000, 25000, 21 000 и некоторые другие. Большинство этих полос соответствует различным фрагментам тяжелых цепей. Следует обратить внимание на то, что, несмотря на наличие разрывов в полипептидных цепях, активность тяжелого меромиозина как АТФазы в полной мере сохраняется. [9]
Для выравнивания объемов в первые 6 проб ( варианты 1 и 2) следует добавить по 0 1 мл воды. Однако при такой постановке эксперимента, строго говоря, не обеспечиваются одинаковые условия взаимодействия фермента с модификатором в вариантах 3 и 4 из-за их концентраций в момент контакта и на первых этапах взаимодействия. Поэтому следует предусмотреть и такую постановку эксперимента, когда в варианте 4 алик-вота фермента ( 0 1 мл) разводится 0 5 М КС1 до 1 мл, затем сюда добавляется 0 1 мл раствора ДНФ и после 0 1 мл среды инкубации, в 10 раз более концентрированной, чем в трех первых вариантах. В результате эксперимента убеждаются в том, что: а) модифицирующий реагент ( ДНФ) вызывает инактивацию фермента в отсутствие субстрата и что субстрат защищает фермент от инактивации; б) активирующее действие ДНФ на АТФазную активность миозина проявляется только в присутствии АТФ. [10]
Миозин составляет 50 - 55 % от сухой массы миофибрилл. Химическая энергия АТФ, освобождающаяся в ходе данной ферментативной реакции, превращается в механическую энергию сокращающейся мышцы. Молекула миозина ( рис. 20.3) имеет сильно вытянутую форму, длину 150 нм. Она может быть расщеплена без разрыва ковалентных связей на субъединицы: две тяжелые полипептидные цепи с мол. Тяжелые цепи образуют длинную закрученную а-спираль ( хвост молекулы), конец каждой тяжелой цепи совместно с легкими цепями создает глобулу ( головка молекулы), способную соединяться с актином. Эти головки выдаются из основного стержня молекулы. Легкие цепи, находящиеся в головке миозиновой молекулы и принимающие участие в проявлении АТФазной активности миозина, гетерогенны по своему составу. Количество легких цепей в молекуле миозина у различных видов животных и в разных типах мышц неодинаково. [11]
Страницы: 1