Cтраница 3
Многократное элюирование удачно выбранными системами растворителей позволяет заметно улучшить разделение гликолипидов. Во время ТСХ в первой системе мигрируют только нейтральные липиды и гликолипиды, а фосфолипиды остаются на старте. В процессе второго элюирования с пластинки вымываются нейтральные липиды, в то время как гликолипиды остаются связанными с неподвижной фазой. При использовании последней элюирующей смеси удаляются свободные жирные кислоты, мигрирующие с подвижной фазой. В этой системе нейтральные липиды имеют большую хроматографическую подвижность, чем моногексозилцер амиды, а все фосфолипиды двигаются медленнее тетрагексозилцерамидов. При использовании описанной методики удается достичь очень хорошего разделения церамидов, моногексозилцерамидов, сульфатидов, дигексозилце-рамидов, психозина, тригекоозилцерамидов, М - ацетилгексозамин-церамидотригексозидов, кардиолипина. [31]
Смесью хлороформ - метанол - вода ( 75: 22: 3) или ( 65: 30: 5) одномерной хроматографией проводят разделение смеси нейтральных липидов, свободных жирных кислот, холестерина, аминокислот и фос-фатидов. В первой системе растворителей значения Rf для отдельных представителей фосфатидов очень низки; во второй - они увеличиваются. Вещества располагаются в порядке убывания RT следующим образом: нейтральные липиды, холестерин, свободные жирные кислоты ( альдегиды), кардиолипиды или аналогичные компоненты, фосфатидил-этаноламин, фосфатидилхолин, лизокефалин, сфингомиелин, лизолеци-тин, аминокислоты. При обнаружении нингидрином и подогреве при 120 в течение 10 минут пятна кефалина, лизокефалина, сфингомиелина и аминокислот приобретают красный цвет. Компоненты, содержащие хо-лин, обнаруживают реактивом Драгендорфа. Лецитин, лизолецитин, сфингомиелин окрашиваются в желто-оранжевый цвет. При высушивании хроматограммы на воздухе, опрыскивании молибдатом аммония и подогреве при 105 в течение 20 минут все вещества окрашиваются в темно-коричневый цвет. [32]
Мембраны состоят в основном из липидов и белков. В клетках млекопитающих содержатся и небольшие количества углеводов, связанных с белками ( гликопротеиды) или с лнпидами. Во внутренних мембранах присутствуют в основном фосфолипи-ды, в плазматических содержатся п нейтральные липиды. Так, в мембранах эритроцитов 30 % липидов составляет холестерин. [33]
Добавляя к составным растворителям три-метилборат, они практически исключили возможность взаимных превращений 1 2 - и 1 3-дипальмитинов и, возможно, 1 - и 2-моноглицеридов, которые обычно происходят при разделении на силикагеле G. Кроме того, с помощью метода Поллака и сотрудников можно разделять сложные смеси липидов, содержащие нейтральные липиды, глико - и фосфолипиды. После этого пластинки поворачивают на 90 для элюирования во втором направлении смесью бензол-этилацетат-триметилборат ( 100: 20: 7 2) при такой же длине пути элюирования. [34]
Система хлороформ - метанол - вода ( 65: 25: 4) и сходные с ней [212, 253] подходят для разделения смеси нейтральных липидов с наиболее часто встречающимися фосфолипидами всех классов. Эти фосфолипиды нестабильны в кислых растворителях и могут разлагаться при элюировании и упаривании. Методом ТСХ с использованием этой системы для элюи-рования можно разделить лизофосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидилхолин с фосфатидилинозитом, фосфатидилэтанола-мин с фосфатидилсерином, фосфатидилглицерин с кардиолипи-ном и фосфатидной кислотой, нейтральные липиды. [35]
Ниже в качестве примера указаны некоторые красители и их применимость для микроскопических исследований. Краситель солохромцианин применяется для выявления основных и кислотных белков в кислых растворах, в этих условиях нуклеиновые кислоты окрашиваются в синий цвет, а основные белки - в красный; метиловый зеленый специфически окрашивает дезоксирибонуклеи-мовую кислоту в зеленый цвет, а пиронин Ж - рибонуклеиновую кислоту в красный; альциановый синий в смеси с оранжевым Ж окрашивает различные элементы гипофиза человека в пурпурово-красный, синий, оранжевый и сине-черный цвета; кармин окрашивает ядра клетки в темно-синий цвет, а гликоген - в красный, что используется для обнаружения гликогена и других углеводов. Для идентификации жиров и жироподобкых веществ - липидов используется их способность хорошо растворяться в судаковых и некоторых других жирорастворимых красителях; судан черный Б окрашивает липиды в черный цвет, смесь суданов III и IV - в различные оттенки от оранжево-красного до оранжевого, а нильский голубой окрашивает нейтральные липиды в красный или розовый цвета, кислые липиды - в синий цвет. [36]
Наиболее широко используемым методом является, однако, адсорбционная хроматография ( колоночная или тонкослойная) на оксиде кремния или промытом кислотой флорисиле. Для количественной оценки используют гравиметрию или газожидкостную хроматографию входящих в состав анализируемого образца жирных кислот ( после введения внутреннего стандарта); при анализе с помощью тонкослойной хроматографии применяют также ден-ситометрию или флуориметрию. Нейтральные липиды элюируют с колонки хлороформом, гликолипиды - ацетоном, фосфолипиды - метанолом. Нейтральные липиды затем разделяют на второй колонке с оксидом кремния: углеводороды элюируют чистым гекса-ном; сложные эфиры холестерина - гексаном, содержащим 2 % эфира; триацилглицерины - гексаном с 5 % эфира; холестерин и диацилглицерины - гексаном с 15 % эфира; моноацилглицери-ны - чистым эфиром. [37]
На первой стадии разделения подвижная фаза ( гексан - эфирный раствор) поднималась по всей длине подложки-стержнк. В этих условиях нейтральные липиды разделялись, а фосфолипиды оставались практически на старте. После улетучивания растворителя разделенные нейтральные липиды детектировались на стержне с помощью прибора Ятроскан ТН-10, причем детектирование прекращали прежде, чем пламя достигало начальной зоны фосфолипидов. Для этого на заданной по длине стержня точке детектирование автоматически прекращалось и стержень извлекался из прибора. [38]
Кауфман и Висманатан [11] использовали смесь петролей-ного эфира ( 35 - 45 С) и бензола ( 4: 7) и силикагель G. Этот растворитель элюирует нейтральные липиды, к которым относятся углеводороды, сложные эфиры стеринов, триглицериды, свободные жирные кислоты, диглицериды и стерины, тогда как полярные липиды ( гликолипиды, фосфолипиды и гли-козиды) стеринов остаются вверху колонки. Полярные липиды Николе элюировал смесью эфира с метанолом ( 1: 1) и метанолом, после чего разделял нейтральные липиды на кремневой кислоте, применив смесь гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота ( 70: 30: 1) в качестве элюирующего растворителя. [39]
Многократное элюирование удачно выбранными системами растворителей позволяет заметно улучшить разделение гликолипидов. Во время ТСХ в первой системе мигрируют только нейтральные липиды и гликолипиды, а фосфолипиды остаются на старте. В процессе второго элюирования с пластинки вымываются нейтральные липиды, в то время как гликолипиды остаются связанными с неподвижной фазой. При использовании последней элюирующей смеси удаляются свободные жирные кислоты, мигрирующие с подвижной фазой. В этой системе нейтральные липиды имеют большую хроматографическую подвижность, чем моногексозилцер амиды, а все фосфолипиды двигаются медленнее тетрагексозилцерамидов. При использовании описанной методики удается достичь очень хорошего разделения церамидов, моногексозилцерамидов, сульфатидов, дигексозилце-рамидов, психозина, тригекоозилцерамидов, М - ацетилгексозамин-церамидотригексозидов, кардиолипина. [40]
Кауфман и Висманатан [11] использовали смесь петролей-ного эфира ( 35 - 45 С) и бензола ( 4: 7) и силикагель G. Этот растворитель элюирует нейтральные липиды, к которым относятся углеводороды, сложные эфиры стеринов, триглицериды, свободные жирные кислоты, диглицериды и стерины, тогда как полярные липиды ( гликолипиды, фосфолипиды и гли-козиды) стеринов остаются вверху колонки. Полярные липиды Николе элюировал смесью эфира с метанолом ( 1: 1) и метанолом, после чего разделял нейтральные липиды на кремневой кислоте, применив смесь гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота ( 70: 30: 1) в качестве элюирующего растворителя. [41]
Липопротеины составляют большую группу сложных белков. Эти макромолекулы в значительных количествах находятся в митохондриях, из них в основном состоит эндоплазматический ретикулум, их обнаруживают и в плазме крови, и в молоке. Их молекулярная масса достигает миллиона дальтон. Гидрофильность белковой и гидрофобность простетической группы липопротеинов определяют ту роль, которую они играют в процессах избирательной проницаемости. Липиды, входящие в состав липопротеинов, отличаются по строению и биологическим свойствам. В частности, в составе липопротеинов открыты нейтральные липиды, фосфолипиды, холестерин и др. Липидный компонент соединяется с белком при помощи нековалентных связей различной природы. Так, нейтральные липиды соединяются с белком посредством гидрофобных связей. Если же в образовании липопротеина участвует фосфолипид, то он взаимодействует с белком при помощи ионных связей. [42]
Липопротеины составляют большую группу сложных белков. Эти макромолекулы в значительных количествах находятся в митохондриях, из них в основном состоит эндоплазматический ретикулум, их обнаруживают и в плазме крови, и в молоке. Их молекулярная масса достигает миллиона дальтон. Гидрофильность белковой и гидрофобность простетической группы липопротеинов определяют ту роль, которую они играют в процессах избирательной проницаемости. Липиды, входящие в состав липопротеинов, отличаются по строению и биологическим свойствам. В частности, в составе липопротеинов открыты нейтральные липиды, фосфолипиды, холестерин и др. Липидный компонент соединяется с белком при помощи нековалентных связей различной природы. Так, нейтральные липиды соединяются с белком посредством гидрофобных связей. Если же в образовании липопротеина участвует фосфолипид, то он взаимодействует с белком при помощи ионных связей. [43]