Cтраница 3
Раствор фильтруют и подкисляют 50 мл уксусной кислоты до рН 5 по универсальной бумаге. Выпадает темно-вишневый осадок аминофлуоресцеина I. Осадку дают отстояться ( 10 часов) и отфильтровывают. Осадок на воронке промывают 200 мл дистиллированной воды, тщательно отжимают и сушат в сушильном шкафу при 100 - 105 до постоянного веса. [31]
I изомер) и 219 - 220 ( II изомер), обычно являются хроматографически чистыми и не содержат примеси изомера либо других красителей. Примесями, наиболее часто сопутствующими аминофлуоресцеину I, являются вещества, дающие розовые пятна с Rf 0 и Rf 0 05, флуоресцирующие зеленым в ультрафиолете, и вещество, дающее пятно с Rf 0 22 - 0 25, флуоресцирующее в ультрафиолете голубовато-зеленым светом. Однако целый ряд образцов, оказавшихся непригодными для метки белков, содержит большое количество примесей, иногда дающих на хроматограмме полосы, тянущиеся от старта к фронту. [32]
Процесс хроматографии осуществляют так же, как и в случае нитрофлуоресцеинов, однако для прохождения фронта растворителя нужно 15 - 17 часов. Флуоресцеинизотиоцианат I дает светло-желтое пятно с Rf 0 26 - 0 33, II изомер-с Rf 0 35, причем разница в Rf двух изомеров составляет обычно 0 05; аминофлуоресцеин I дает четкое концентрированное пятно с Rf 0 09 - 0 13, II изомер - вытянутое размытое пятно, Rf которого колеблется в пределах 0 5 - 0 7; пятна обоих изомеров окрашены в желто-оранжевый цвет и так же, как пятна изо-тиоцианатов, флуоресцируют зеленым при облучении ультрафиолетовым светом с длиной волны 253 или 365 ммк. [33]
Растворяют 17 4 г аминофлуоресцеина I в 480 мл ацетона, фильтруют. В трехгорлую колбу емкостью 1 л, снабженную мешалкой, термометром, капельной воронкой и хлоркальциевой трубкой, загружают 10 1 г цианурхлорида и 85 мл ацетона. Уже после прибавления первых порций раствора аминофлуоресцеина начинает выпадать светло-желтый осадок. Перемешивают еще 3 5 час при 2 - 4 и оставляют на 20 ч при комнатной температуре. [34]
Раствор флуоресцеинизотиоцианата I в 0 05 М растворе Na2HPO4 имеет в видимой области один максимум поглощения при 493 ммк. Оптическая плотность этого раствора уменьшается со временем, поэтому его нельзя использовать для количественных измерений. Коэффициент экстинкции флуоресцеинизотиоцианата оказывается заниженным по сравнению с величиной емакс аминофлуоресцеина, по-видимому, вследствие того, что не удается полностью очистить препарат изотиоцианата от не поглощающих в этой области примесей. [35]
В щелочном растворе метил-тиокарбамат очень быстро превращается в аминофлуоресцеин, как показывает хроматография на бумаге. Определив оптическую плотность растворов в максимуме поглощения ( 490 ммк), нетрудно было рассчитать содержание отдельных компонентов ( изотиоцианата, амина и веществ у старта) IB образце. При этом мы принимали, что вещества, находящиеся у старта, имеют тот же коэффициент экстинкции и молекулярный вес, что и аминофлуоресцеин. Метод был применен для анализа искусственных смесей, полученных прибавлением аминофлуоресцеина I к исходному образцу флуоресцеинизотиоцианата ( табл. 2, образец 1), содержание компонентов в котором было предварительно определено. Как показывает табл. 2 ( образцы 2 - 4), метод дает хорошие результаты при определении содержания отдельных компонентов в образцах. Относительная ошибка при определении флуо-ресцеинизотиоцианата составляет всего 1 7 %; в случае аминофлуоресцеина и красителей у старта она значительно выше ( 20 и 25 % соответственно) ввиду небольших количеств этих веществ. [36]
В щелочном растворе метил-тиокарбамат очень быстро превращается в аминофлуоресцеин, как показывает хроматография на бумаге. Определив оптическую плотность растворов в максимуме поглощения ( 490 ммк), нетрудно было рассчитать содержание отдельных компонентов ( изотиоцианата, амина и веществ у старта) IB образце. При этом мы принимали, что вещества, находящиеся у старта, имеют тот же коэффициент экстинкции и молекулярный вес, что и аминофлуоресцеин. Метод был применен для анализа искусственных смесей, полученных прибавлением аминофлуоресцеина I к исходному образцу флуоресцеинизотиоцианата ( табл. 2, образец 1), содержание компонентов в котором было предварительно определено. Как показывает табл. 2 ( образцы 2 - 4), метод дает хорошие результаты при определении содержания отдельных компонентов в образцах. Относительная ошибка при определении флуо-ресцеинизотиоцианата составляет всего 1 7 %; в случае аминофлуоресцеина и красителей у старта она значительно выше ( 20 и 25 % соответственно) ввиду небольших количеств этих веществ. [37]
В щелочном растворе метил-тиокарбамат очень быстро превращается в аминофлуоресцеин, как показывает хроматография на бумаге. Определив оптическую плотность растворов в максимуме поглощения ( 490 ммк), нетрудно было рассчитать содержание отдельных компонентов ( изотиоцианата, амина и веществ у старта) IB образце. При этом мы принимали, что вещества, находящиеся у старта, имеют тот же коэффициент экстинкции и молекулярный вес, что и аминофлуоресцеин. Метод был применен для анализа искусственных смесей, полученных прибавлением аминофлуоресцеина I к исходному образцу флуоресцеинизотиоцианата ( табл. 2, образец 1), содержание компонентов в котором было предварительно определено. Как показывает табл. 2 ( образцы 2 - 4), метод дает хорошие результаты при определении содержания отдельных компонентов в образцах. Относительная ошибка при определении флуо-ресцеинизотиоцианата составляет всего 1 7 %; в случае аминофлуоресцеина и красителей у старта она значительно выше ( 20 и 25 % соответственно) ввиду небольших количеств этих веществ. [38]