Бакуловирус
Cтраница 3
Бакуловирусы патогенны для многих видов насекомых, но каждый их штамм специфичен в отношении небольшого числа видов. Обычно гибель инфицированного насекомого происходит лишь спустя довольно длительное время, поэтому бакуловирусы не очень эффективны как средство контроля численности насекомых. Однако в различные штаммы бакуловирусов можно ввести специфические гены, и тогда вирус может действовать как система доставки гена, обеспечивающего синтез инсектицида в течение всего жизненного цикла вируса. Проведены предварительные испытания в лабораторных условиях, которые дали положительные результаты. Кроме того, в бакуловирус был введен ген нейротоксина, смертельного для насекомых, и были проведены полевые испытания. [31]
Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего геном чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомби-нантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтеззу большого количества гетерологичного белка, который благодаря сходству систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и млекопитающих будет близок ( а возможно, и идентичен) к нативной форме того белка, который интересует исследователя. Исходя из этого на основе бакуловирусов были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных. [32]
Одно из преимуществ бакуловирусов как инструмента биоконтроля численности насекомых состоит в избирательности их действия. С одной стороны, это означает, что данный бакуловирус может использоваться для контроля численности только определенных насекомых-вредителей. Но с другой, благодаря тому что бакуловирусы эволюционировали в течение многих тысяч лет совместно со своими насекомыми-хозяевами, они научились преодолевать их защитные механизмы, а потому устойчивость к этим вирусам развивается крайне редко - гораздо реже, чем к В. Более того, устойчивые к бакуловирусам насекомые быстро утрачивают эту способность после того, как прекращают взаимодействовать с вирусами. [33]
Этот бакуловирус инфицирует более 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих клеточных линий. Линии клеток, обычно использующиеся для работы с рекомбинантным AcMNPV, получают из гусениц Spodopterafrugiperda. Промотор полиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка. [34]
Культуру клеток насекомого, трансфициро-ванную ДНК AcMNPV, трансфицируют затем транспортным вектором, несущим клонированный ген. В некоторых дважды трансфицирован-ных клетках происходит двойной кроссинговер, в результате которого клонированный ген вместе с промотором и сигналом терминации транскрипции гена полиэдрина встраивается в ДНК AcMNPV ( рис. 7.9), замещая ген полиэдрина. Вирионы, не содержащие этого гена, образуют зоны клеточного лизиса, из которых можно выделить рекомбинантный бакуловирус. [35]
Фермент выделили из насекомого Heliothis virescens ( совки) и очистили. Определили его аминокислотную последовательность, синтезировали олигонуклеотид, соответствующий одному из сегментов белковой молекулы, и использовали его в качестве зонда для гибридизации. После обработки таким рекомби-нантным бакуловирусом Trichoplusia ni ( совки ни), находящейся на первой личиночной стадии развития, содержание ювенильного гормона у насекомого снизилось, а рост личинок резко замедлился по сравнению с таковыми контрольных личинок, обработанных бакуловирусом дикого типа. [36]
В результате двойного кроссинговера между вектором и геном AcMNPV клонированный ген встраивался в последний и попадал под контроль сильного промотора, функционирующего на последних стадиях литического цикла. Клетки насекомого, инфицированные рекомбинант-ным бакуловирусом, синтезировали гетероло-гичный белок. [38]
Одно из преимуществ бакуловирусов как инструмента биоконтроля численности насекомых состоит в избирательности их действия. С одной стороны, это означает, что данный бакуловирус может использоваться для контроля численности только определенных насекомых-вредителей. Но с другой, благодаря тому что бакуловирусы эволюционировали в течение многих тысяч лет совместно со своими насекомыми-хозяевами, они научились преодолевать их защитные механизмы, а потому устойчивость к этим вирусам развивается крайне редко - гораздо реже, чем к В. Более того, устойчивые к бакуловирусам насекомые быстро утрачивают эту способность после того, как прекращают взаимодействовать с вирусами. [39]
Другой подход к повышению эффективности инсектицидного действия бакуловирусов основан на включении в вирусный геном гена мощного насекомоспецифичного токсина, который экспрессировался бы во время цикла вирусной инфекции. В один из штаммов бакуловируса был введен ген насекомоспецифичного нейро-токсина, синтезируемого североафриканским скорпионом, Androctonus australis Hector. Этот нейротоксин, не оказывающий никакого действия на мышей, блокирует транспорт ионов натрия в нейронах насекомых-мишеней, что приводит к параличу и смерти. Насекомые, которые были инфицированы бакуловирусом, несущим ген нейротоксина скорпиона, повреждали листья контрольных растений на 50 % меньше, чем насекомые, инфицированные бакуловирусом дикого типа. [40]
Другой подход к повышению эффективности инсектицидного действия бакуловирусов основан на включении в вирусный геном гена мощного насекомоспецифичного токсина, который экспрессировался бы во время цикла вирусной инфекции. В один из штаммов бакуловируса был введен ген насекомоспецифичного нейро-токсина, синтезируемого североафриканским скорпионом, Androctonus australis Hector. Этот нейротоксин, не оказывающий никакого действия на мышей, блокирует транспорт ионов натрия в нейронах насекомых-мишеней, что приводит к параличу и смерти. Насекомые, которые были инфицированы бакуловирусом, несущим ген нейротоксина скорпиона, повреждали листья контрольных растений на 50 % меньше, чем насекомые, инфицированные бакуловирусом дикого типа. [41]
Фермент выделили из насекомого Heliothis virescens ( совки) и очистили. Определили его аминокислотную последовательность, синтезировали олигонуклеотид, соответствующий одному из сегментов белковой молекулы, и использовали его в качестве зонда для гибридизации. После обработки таким рекомби-нантным бакуловирусом Trichoplusia ni ( совки ни), находящейся на первой личиночной стадии развития, содержание ювенильного гормона у насекомого снизилось, а рост личинок резко замедлился по сравнению с таковыми контрольных личинок, обработанных бакуловирусом дикого типа. [42]
Бакуловирусы патогенны для многих видов насекомых, но каждый их штамм специфичен в отношении небольшого числа видов. Обычно гибель инфицированного насекомого происходит лишь спустя довольно длительное время, поэтому бакуловирусы не очень эффективны как средство контроля численности насекомых. Однако в различные штаммы бакуловирусов можно ввести специфические гены, и тогда вирус может действовать как система доставки гена, обеспечивающего синтез инсектицида в течение всего жизненного цикла вируса. Проведены предварительные испытания в лабораторных условиях, которые дали положительные результаты. Кроме того, в бакуловирус был введен ген нейротоксина, смертельного для насекомых, и были проведены полевые испытания. [43]
 |
Некоторые свойства инсектицидных токсинов, синтезируемых разными штаммами В. thuringiensis1 1. [44] |
Дело в том, что эти соединения, как правило, высокоспецифичны и подвергаются быстрой биодеградации, поэтому устойчивость к ним вырабатывается медленно. К сожалению, они не очень эффективны, а их получение обходится дорого, что ограничивает возможность их широкого применения. Есть надежда, что все эти проблемы удастся решить с помощью технологий рекомбинантных ДНК. Теперь для увеличения эффективности микробиологических инсектицидов исследователи могут проводить манипуляции с генами, которые кодируют их биосинтез. В частности, речь может идти о генах инсектицидов, вырабатываемых бактерией Bacillus thuringiensis или бакуловирусами насекомых; эти инсектициды безопасны, специфичны и весьма эффективны. [45]
Страницы: 1 2 3 4