Метод - эдман
Cтраница 1
Метод Эдмана, разработанный для N-концевых аминокислот ( аминокислот со свободной МН2 - группой), основан на реакции полипептидов или белков с фенилизотиоцианатом, образующим фенилтиомочевину по концевой МН2 - группе. [1]
Метод Эдмана заключается во взаимодействии N-концевой 1минокислоты с фенилизотиоцианатом в щелочной среде. [2]
Метод Эдмана последовательной деградации пептидов и белков основан на реакции фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой в щелочной среде, которая приводит сначала к образованию тиомочевинной метки концевой аминокислоты, последняя при действии CF3COOH отщепляется, в конечном счете, в виде замещенного фенилтиогидантоина, после чего полипептидная цепь белка укорачивается на один аминокислотный остаток. [3]
Преимущество метода Эдмана состоит в том, что при отщеп - 1ии каждой концевой a - аминокислоты остальная часть пептид - R молекулы не разрушается и операции по отщеплению можно вторять. [4]
При помощи метода Эдмана был изучен порядок чередования аминокислот в пептидах, однако до последнего времени использование этого метода для количественного анализа концевых аминокислот в белках с высоким молекулярным весом имело лишь частичный успех. [5]
В начале применение метода Эдмана было сопряжено с определенными трудностями вследствие нерастворимости больших пептидов в безводных средах и плохого выхода получаемых ФТГ-производ-ных. [6]
При успешном применении метода Эдмана удавалось отщепить последовательно 5 - 7 остатков при незначительном неспецифическом расщеплении. В некоторых случаях последовательное расщепление пептида осуществлялось удивительно легко. [7]
Второй метод исследования N-концов ( метод Эдмана) называется фенилтиогидантоинным методом. [8]
Независимо от того, какая модификация метода Эдмана используется, после каждого цикла необходимо собирать производные 2-анилинотиазолона - 5 Af-концевых аминокислот и превращать их в 2-тио - З - фенилгидантоины ( 12) нагреванием с трифторуксусной кислотой. Известно несколько методов [23] идентификации 2-тио-гидантоинов. До того, как были разработаны удобные способы отделения 2-тиогидантоинов. При гидролизе, однако, неизбежно разрушаются некоторые гидантоины ( например, гидантоиновые производные серина и треонина), и в настоящее время предпочитают методы прямого их определения. [9]
 |
Схема коммуникаций жидкофазного секвенатора белков. [10] |
Другими вариантами ступенчатой деградации являются комбинация метода Эдмана с дансильным методом [ 108 - ПО ], микроопределение на фильтровальной бумаге, тонкослойная хроматография на полиамидных слоих и конденсации с пентафторфенилизотиоцианатом. [11]
Главная трудность, возникающая при изучении методом Эдмана белков, состоит в том, что ФТК-белки и большие ФТК-пептиды во многих случаях оказываются нерастворимыми в безводной кислой среде, применяемой на стадии циклизации. Чтобы преодолеть это препятствие, Френкель-Конрат [58] предложил удачную модификацию - проводить все операции на тонком слое белка, адсорбированном на фильтровальной бумаге. [12]
Секвенирование полипептидов проводят методом, известным как метод Эдмана. Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую а-аминогруппу, каким-либо алкил - или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде приводит к образованию соответствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой среде ( при значениях кислотности, не повреждающих пептидные связи) отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина. [13]
Другим химическим методом определения N-концевых групп является метод Эдмана - реакция с фенилизотиоцианатом. Фенилтиокарбамилъный пептид, получающийся при этой реакции, быстро расщепляется в кислой среде с образованием 5-тиазолинона N-концевой аминокислоты и остатка пептида. [14]
Для определения N-концевой аминокислоты значительно более широко применяется фенилтиогидантоиновый метод Эдмана благодаря своей высокой чувствительности и возможности многократного использования в одной и той же пробе. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной a - NH2 - rpynnoft N-концевой аминокислоты полипептида с образованием фенилтиокарбамоилпептида. [15]
Страницы: 1 2