Монохроматор - возбуждение
Cтраница 2
Например, при 250 нм коэффициент погашения раствора антрацена примерно в 80 раз больше, чем при 366 нм, и при возбуждении ртутной лампой высокого давления это увеличение абсолютной чувствительности дает выигрыш, несмотря на меньшую интенсивность излучения при 250 нм. Переход от 366 к 250 нм, однако, не дает никакого выигрыша в случае ксеноновой лампы, если только не расширить при этом щель на монохроматоре возбуждения. Что касается анализирующего монохроматора, то в этом случае чувствительность прибора будет зависеть от его ширины полосы и спектральной области люминесценции. [16]
При измерении спектров люминесценции сканируется длина волны испускаемого света. При измерении спектров возбуждения, наоборот, монохроматор испускаемого света устанавливается на определенной длине волны ( например, в максимуме спектра флуоресценции), а сканируется длина волны возбуждения. Щели монохроматора возбуждения должны быть достаточно малыми, чтобы получить хорошо разрешенный спектр. Получаемая при этом зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны возбуждающего света, прокалиброванная с учетом интенсивности возбуждающего света, и является спектром возбуждения данной люминесценции. После исправления полученного спектра с учетом спектрального распределения источника возбуждения он должен совпадать со спектром поглощения люминесцирующего вещества. [17]
Существуют три типа физических приборов, которые обычно используются для детектирования или измерения света в видимой и ультрафиолетовой областях: термобатарея, различные типы фотоэлементов и фотоэлектронные умножители. Для измерения флуоресценции и фосфоресценции ( особенно низкой интенсивности) используется исключительно фотоумножитель из-за его высокой чувствительности. Для измерения больших интенсивно-стей, например в пучке света после монохроматора возбуждения, иногда удобнее применять вакуумный фотоэлемент, а термобатарея обычно используется как первичный стандарт для абсолютных измерений излучения. Ниже будут рассмотрены конструкция и принцип работы всех трех типов детекторов. [18]
 |
Схемы включения ксеноновой и ртутной ламп. [19] |
Хотя мощные лампы позволяют получать свет большой интенсивности, они дороги и очень сильно нагреваются. Чаще всего используют лампы мощностью от 250 до 500 Вт. Они имеют малую дугу большой яркости, так что на входную щель монохроматора возбуждения можно сфокусировать сравнительно большую долю света. При низком разрешении эти линии не играют роли, но могут проявляться при высоком разрешении. [20]
Адзуми и Мак-Глинн [64] описали другие методы корректировки. Один из этих методов основан на том, что при довольно малой вязкости растворителя и большом времени испускания наблюдается полная вращательная деполяризация. Они измерили кажущуюся поляризацию флуоресценции 10 - 4 М раствора фенантрена в метилциклогексане и нашли, что R и R меняются с изменением длины волны как монохроматора возбуждения, так и монохроматора люминесценции. Однако при постоянной длине волны монохроматора люминесценции отношение Ri / R остается постоянным по всему спектру возбуждения. Они сделали вывод, что в действительности флуоресценция была неполяризована и что изменение R и R вызвано прибором. [21]
При измерении спектров люминесценции сканируется длина волны излучаемого света. При изучении спектров возбуждения, наоборот, монохроматор анализатора устанавливается на определенной длине волны ( например, в максимуме спектра флуоресценции), а сканируется длина волны возбуждения. Щели монохроматора возбуждения должны быть достаточно малыми, чтобы получить хорошо разрешенный спектр. Получаемая при этом зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны, прокалиброванная с учетом интенсивности возбуждающего света, и является спектром возбуждения данной люминесценции. После исправления полученного спектра с учетом спектрального распределения источника возбуждения он должен совпадать со спектром поглощения люминесцирующего вещества. [22]
Свет, выходящий из монохроматора, теоретически не должен содержать никаких других длин волн, кроме линии, на которую установлен монохроматор, и налагающихся линий второго порядка решетки. На практике же свет, выходящий из монохрома-тора, содержит небольшую долю всех длин волн, которые входят в монохроматор. Доля рассеянного света в решеточных приборах обычно больше, чем в призменных, и эта доля зависит от качества оптических деталей и конструкции монохроматора. Особенно трудно измерять слабую люминесценцию при одной длине волны в присутствии очень сильной полосы люминесценции при другой длине волны. Рассеянный свет монохроматора возбуждения может налагаться точно так же, как свет второго порядка спектра, о котором говорилось ранее. Примеры осложнений вследствие рассеяния света обсуждаются в гл. [23]
Помехи, вызванные рассеянным светом, подобно помехам от флуоресценции кюветы, будут наименьшими при освещении под прямым углом. Если же для возбуждения и регистрации используются двойные призменные монохроматоры, то от этих помех всегда можно избавиться даже при фронтальном освещении, ибо максимум рассеянного света появляется при более короткой длине волны, чем флуоресценция. Однако в большинстве приборов используются обычные монохроматоры, и рассеянный свет может вызывать помехи различными путями. Обычно помехи обусловлены нежелательными длинами волн в пучке возбуждающего света. Они образуются при рассеянии внутри монохроматора возбуждения ( см. раздел III, Б, 10) и могут приводить к большому фону при работе с высокой чувствительностью. Так, кривая Г ( см. рис. 150) - это спектр чистого циклогексана, когда для выделения возбуждающей линии ртути 250 нм был использован решеточный монохроматор. Почти весь спектр обусловлен небольшим количеством случайного света всех длин волн, прошедшего через монохроматор возбуждения, рассеянного растворителем и попавшего в анализирующий монохроматор 1 - на кривой Г ясно видны максимумы, отвечающие линиям ртути 302, 313, 334, 366, 405 и 436 нм. [24]
Не менее важным являются облучение образца и регистрация возникающей люминесценции. Ниже будут обсуждены различные способы облучения, образца и конструкции кюветного отделения. Здесь следует рассмотреть общие требования, обеспечивающие эффективную регистрацию люминесценции вторым монохроматором. Рассуждения относительно размера источника света и его фокусирования на входную щель монохроматора возбуждения полностью применимы и к монохроматору люминесценции, за исключением того, что в данном случае источником света служит освещаемая площадь образца. Поэтому для того, чтобы собрать как можно больше света люминесценции, освещаемая площадь образца должна быть небольшой и ее следует фокусировать на входную щель монохроматора люминесценции так, чтобы заполнить ее и коллиматор светом. Ясно, что чем короче фокусное расстояние линзы выходной щели монохроматора возбуждения, тем меньше облучаемая площадь образца и поэтому тем больше доля света люминесценции, попадающая в анализирующий монохроматор. Однако при этом необходимо иметь в виду, что при очень больших интенсивностях света образец слишком быстро претерпевает фотохимическое разложение. [25]
Не менее важным являются облучение образца и регистрация возникающей люминесценции. Ниже будут обсуждены различные способы облучения, образца и конструкции кюветного отделения. Здесь следует рассмотреть общие требования, обеспечивающие эффективную регистрацию люминесценции вторым монохроматором. Рассуждения относительно размера источника света и его фокусирования на входную щель монохроматора возбуждения полностью применимы и к монохроматору люминесценции, за исключением того, что в данном случае источником света служит освещаемая площадь образца. Поэтому для того, чтобы собрать как можно больше света люминесценции, освещаемая площадь образца должна быть небольшой и ее следует фокусировать на входную щель монохроматора люминесценции так, чтобы заполнить ее и коллиматор светом. Ясно, что чем короче фокусное расстояние линзы выходной щели монохроматора возбуждения, тем меньше облучаемая площадь образца и поэтому тем больше доля света люминесценции, попадающая в анализирующий монохроматор. Однако при этом необходимо иметь в виду, что при очень больших интенсивностях света образец слишком быстро претерпевает фотохимическое разложение. [26]
Помехи, вызванные рассеянным светом, подобно помехам от флуоресценции кюветы, будут наименьшими при освещении под прямым углом. Если же для возбуждения и регистрации используются двойные призменные монохроматоры, то от этих помех всегда можно избавиться даже при фронтальном освещении, ибо максимум рассеянного света появляется при более короткой длине волны, чем флуоресценция. Однако в большинстве приборов используются обычные монохроматоры, и рассеянный свет может вызывать помехи различными путями. Обычно помехи обусловлены нежелательными длинами волн в пучке возбуждающего света. Они образуются при рассеянии внутри монохроматора возбуждения ( см. раздел III, Б, 10) и могут приводить к большому фону при работе с высокой чувствительностью. Так, кривая Г ( см. рис. 150) - это спектр чистого циклогексана, когда для выделения возбуждающей линии ртути 250 нм был использован решеточный монохроматор. Почти весь спектр обусловлен небольшим количеством случайного света всех длин волн, прошедшего через монохроматор возбуждения, рассеянного растворителем и попавшего в анализирующий монохроматор 1 - на кривой Г ясно видны максимумы, отвечающие линиям ртути 302, 313, 334, 366, 405 и 436 нм. [27]
Полный анализ сложной смеси, состоящей из компонентов с перекрывающимися спектрами возбуждения и испускания люминесценции, в принципе можно осуществить, измеряя спектры испускания смеси, возбуждаемые большим числом длин волн. Он представил результаты в виде матрицы т X tt, в которой столбцы т определяются длинами волн возбуждения, а ряды п - наблюдаемыми длинами волн. Матричные элементы представляют собой числа, пропорциональные показанию детектора. В общем, ранг матрицы дает число компонентов в системе, имеющих различные спектры поглощения и флуоресценции. По-видимому, с использованием ЭВМ метод может стать мощным орудием для исследования сложных смесей неизвестных люминесцирующих компонентов. Однако последовательная запись полных спектров является трудоемким делом, и Шахтер и Хенни [436] описали иной подход к этой проблеме. В их методе монохроматоры возбуждения и испускания сканируются одновременно и их сигналы подаются на осциллограф. Вдоль оси X меняется длина волны испускания, вдоль оси У - длина волны возбуждения, а пучок электронов отпирается только тогда, когда интенсивность испускания достигает заранее выбранного значения. В результате этого на экране возникает флуорограмма, или некий контур, соответствующий данному уровню интенсивности. Затем комбинация флуорограмм, соответствующих нескольким уровням интенсивности, преобразуется в трехмерную модель, или стереофлуорограмму, которая отражает все три спектральных параметра. Шахтер и Хенни применили эту методику к полиядерным ароматическим углеводородам и предложили использовать ее для получения отпечатков пальцев чистых соединений. [28]
Метод освещения в линию ( г на рис. 78) дает для разбавленных растворов неискаженные спектры возбуждения и испускания, и сигнал пропорционален концентрации флуоресцирующего вещества. В этом отношении этот метод похож на фронтальный метод и метод освещения под прямым углом. Применение этого метода для измерения очень слабой флуоресценции имеет два серьезных недостатка. Первый состоит в том, что непоглощенный возбуждающий свет непосредственно поступает в анализирующий монохроматор, и если используется одинарный монохроматор, то некоторое количество света, рассеиваемое в монохроматоре, будет проходить через выходную щель при всех длинах волн, и слабое испускание раствора может быть замаскировано этим фоновым испусканием. Этот недостаток может быть устранен использованием двойного монохрома-тора для анализа флуоресценции или использованием фильтра, расположенного между образцом и анализирующим монохро-матором, который поглощает возбуждающий свет, но пропускает флуоресценцию. Этот фильтр должен иметь очень слабую собственную флуоресценцию. Вторым недостатком является наложение нежелательных длин волн возбуждающего света. Оно может вызываться рассеянием света внутри монохроматора возбуждения ( если это одинарный монохроматор) или фильтрами, которые используются для выделения нужной длины волны возбуждающего света. Нежелательные длины волн возбуждающего света в области полосы флуоресценции будут проходить прямо через второй монохроматор и вызывать очень большой фон. Вопросы, связанные с флуоресценцией фона, подробно обсуждаются в гл. [29]
В принципе это просто, но на практике при такой конструкции очень трудно достигнуть высокой чувствительности, так как много света теряется. Свет источника распространяется во всех направлениях, и только небольшая доля его попадает в первый монохроматор. Из этой доли лишь узкая полоса длин волн направляется на образец, который чаще всего поглощает не более 1 % света, остальная же часть пропускается и не используется вовсе. Свет флуоресценции тоже распространяется во всех направлениях, и только небольшая его часть собирается вторым монохроматором. Этот свет снова диспергируется, и опять выделяется узкая полоса длин волн, так что окончательная интенсивность света, падающего на детектор, составляет очень малую долю от света, испускаемого источником. Такие потери света уменьшают несколькими способами. Очевидно, лучше использовать наиболее мощную лампу, наиболее чувствительный детектор и по возможности большие монохроматоры. Но даже с очень большими и дорогими монохроматорами чувствительность будет оставаться довольно низкой, если измерения проводить при очень узких щелях на обоих монохроматорах. Например, Паркер [73] получил хорошо разрешенные спектры возбуждения антрацена при концентрации менее 10 - 8 вес. Аналогичные чувствительность и разрешение можно получить при измерении спектра флуоресценции при широких щелях монохроматора возбуждения. [30]
Страницы: 1 2