Cтраница 2
Большие усилия направляются на поиск нуклеаций - зародышей процесса свертывания, которые, как предполагают, служат основой дальнейшего свертывания. Такие зародышевые образования должны иметь исключительно стабильную структуру. Возможно, что их можно будет обнаружить с помощью антител или экспериментов с повторным свертыванием модифицированных белков. Локализация зародышей должна в большой мере облегчить моделирование свертывания. В любом случае очевидно, что понадобится еще очень большое число экспериментов, прежде чем загадка процесса свертывания будет разрешена. [16]
Наконец, последней из рассматриваемых реакций ацилиро-вания является реакция с карбобензоксихлоридом. Ее механизм аналогичен таковому для свободных аминокислот. Реакция идет при температуре 0 - 25 в слабощелочной среде ( рН 8), причем реагируют главным образом аминогруппы и в незначительной степени другие основные группы. Этот реактив широко применялся для прикрытия аминогрупп при получении модифицированных белков, а также при изучении роли аминогрупп в биологической активности вируса табачной мозаики ( ВТМ), инсулина и других белков. [17]
Кроме того, вследствие мутаций в каждой из цепей гемоглобина возможна замена по крайней мере одной аминокислоты. Из многих гемоглобинов и миоглобинов удается удалить без денатурации белка железопорфириновый комплекс, а затем реконструировать полный белок из белка и порфиринового комплекса, взятых из различных источников, или вместо железопор-фиринового комплекса взять при этом порфириновый комплекс другого металла ( разд. Исследование мутантных форм и химически модифицированных гемоглобинов существенно расширило наши знания о природе реакций гемоглобина, и в последующих разделах мы часто будем использовать результаты, полученные с помощью мутантных и модифицированных белков. [18]
На основании изложенного выше должно быть ясно, что для объяснения влияния химической модификации белков на их биологические свойства необходимо накопить большое количество фактического материала и тщательно его проанализировать. Исследование, в котором применялся какой-либо один реагент и использовались только химические методы, не может вскрыть все факторы, определяющие степень биологической активности. К счастью, имеется значительное число данных о многих весьма чистых белках, например таких, как пепсин, химотрипсин, вирус табачной мозаики, инсулин и лизоцим. Изменение последних двух белков подробно обсуждено в последующих томах настоящего сборника. То же относится и к иммунологическим исследованиям модифицированных белков. [19]
Йозефсон и Эдман [55, 56] описали обратимую инактивацию лизоцима и рибонуклеазы безводной муравьиной кислотой; они объясняли этот факт N. Так, например, хлоргидрат лизоцима был растворен в безводной муравьиной кислоте ( приготовленной высушиванием 98 % - ной муравьиной кислоты над борным ангидридом) и выдержан в течение 16 час при 25; в течение этого времени вся ферментативная активность исчезла. Теоретическое число связей, которые в этих условиях могут претерпевать превращения, определяется наличием в молекуле лизоцима 10 сериновых и 7 треониновых остатков; расход щелочи при рН 7 5 соответствует миграции у 11 остатков. По новейшим данным Иозефсона [57], освобождающиеся аминогруппы формилируются; однако в противовес этой трактовке данные, полученные Рабиновичем [58], Смилли и Нейратом [59], а также Нарита [60], свидетельствуют о том, что реагент просто формилирует гидроксильные группы, а медленное потребление модифицированным белком щелочи объясняется гидролизом формильных эфиров. То, что присоединение формильных групп несомненно имеет место при модифицировании белка, было показано в опытах с использованием меченной С14 муравьиной кислоты. На основании собственного опыта автор считает, что прирост аминного азота, определяемый по методу Ван-Слайка, не может служить достаточно надежным критерием ацильной миграции. Это было обнаружено в исследованиях [61 ] по модифицированию инсулина путем растворения в различных хлорангидридах, когда не было найдено удовлетворительного соответствия между результатами определения аминного азота, которые приближались к рассчитанным величинам, и выходами аминоспиртов после восстанов-ления модифицированного инсулина боргидридом лития. Для лучшего понимания свойств модифицированных белков, образующихся в безводной кислой среде, очевидно, требуются более точные кинетические данные. Все приводимые в литературе величины скорости обратной О М - ацильной миграции в белках, по-видимому, слишком малы. [20]