Cтраница 2
Где-то на младших курсах студентов учат, что белки в зависимости от их растворимости подразделяются примерно на 6 классов; более подходящей классификации белков придумать еще не удалось. Далее студенты узнают, что из крупных белков в дистиллированной воде могут растворяться только альбумины, а все белки других классов требуют для своего растворения дополнительных условий - приходится подбирать нужные концентрации солей, значения рН и диэлектрической постоянной. Значительно меньше известно о влиянии солей на растворимость низкомолекулярных соединений, в частности аминокислот. [16]
Использование ионообменной целлюлозы для очистки белков имеет два наиболее ощутимых преимущества. Во-первых, полимерные цепи ионообменной целлюлозы в среднем сравнительно сильно разделены в пространстве, и поэтому даже очень крупные белки могут свободно диффундировать через ионообменную матрицу, взаимодействуя с заряженными группами. И во-вторых, плотность распределения заряженных групп в ионообменных целлюлозах относительно невелика, и поэтому отдельные молекулы белка взаимодействуют в каждый данный момент лишь с одной или с несколькими заряженными группами смолы - это позволяет элюировать белок с ионообменника в сравнительно мягких условиях. [17]
Для иммуносорбеитов, сорбентов с участием белковых рецепторов или тем более транспортных белков концентрацию лигандов без ущерба для полноты аффинного связывания можно снижать еще на несколько порядков. Это обстоятельство может иметь важное значение в свете не раз подчеркивавшейся опасности многоточечной фиксации белковых лигандов на матрице или же взаимных помех и затрудненной элюдии в случае сорбции крупных белков на тесно расположенных низкомолекулярных лигандах. Кроме того, избыток неиспользуемых лигандов может явиться причиной повышенной неспецифической сорбции. [18]
Особый случай представляет собой отделение белка от свободного детергента. Здесь следует помнить о том, что при концентрациях выше некоторых критических детергенты в водном растворе существуют в виде мицелл, достаточно крупных для того, чтобы не проникать в поры, например сефадекса G-25. Это означает, что отделить от детергентов гель-фильтрацией можно только очень крупные белки на крупнопористых матрицах. [19]
Последняя буква отмечает градацию размера гранул: S ( superfine) - интервал 20 - 40 мкм, М ( medium) - 40 - 80 мкм. Аналогичные обменники производит фирма Merck. Это очень жесткие и химически стойкие ионообменники с порами диаметром в несколько тысяч ангстремов, доступные для макромолекул с массами в миллионы Дальтон. NaOH и НС1 при 25 в течение 10 сут не сказывается на емкости ионообменника. Емкость для малых ионов ( 0 108 мэкв / мл) - примерно такая же, как у ДЭАЭ-се-фарозы и ДЭАЭ-целлюлозы; емкость для крупных белков ( например, тиреоглобулина) выше, чем даже у ДЭАЭ-биогеля А. [20]
Согласно им, в структуре таких белков следует выделять большее число уровней организации. Иерархия берет свое начало от аминокислотной последовательности. Затем следует вторичная структура с регулярной укладкой полипептидной цепи, характеризующейся максимальным образованием водородных связей. Вторичная структура может образовывать до 75 % всей полипептидной цепи. Иногда в молекуле белка можно выделить агрегаты вторичной структуры ( сверхвторичная структура), являющиеся регулярными образованиями из нескольких участков полипептидных цепей, например двойная а-спираль или складчатый лист-спираль. Они возникают у крупных белков и характеризуются как независимые пространственные структуры. Иммуноглобулины, например, образуют при соответствующем сворачивании полипептидных цепей от 2 до 4 доменов. В химотрипсине активный центр находится внутри, между двумя доменами. В данном случае домены имеют структуру складчатого листа-цилиндра и связаны один с другим лишь одной полипептидной цепью. И наконец, глобулярные белки, построенные из нескольких доменов, могут упаковываться в еще более крупные структурные образования. Возникающие при этом агрегаты обычно построены симметрично, причем структура входящих в их состав мономеров, вероятно, не меняется. [21]
Далее Бернарди и Кавазаки показали, что денатурированные белки ( в присутствии 8 М мочевины) связываются с оксиапатитом явно слабее, чем нативные. Это легко понять, если вспомнить, что в нативной конфигурации у цитоплазматических белков гидрофильные остатки аминокислот, в том числе Asp и Glu, экспонированы снаружи белковой глобулы. В статистическом клубке денатурированного белка их относительное представительство на поверхности уменьшается. Представляет интерес замеченная авторами необходимость увеличения концентрации элюирующего фосфатного буфера для снятия с колонки оксиапатита кислых белков при увеличении длины колонки. Данное явление лучше выражено для относительно небольших белков. Уже десорбированный белок при своем движении по длинной колонке имеет больше шансов найти такой участок поверхности сорбента, где он сможет связаться в большем числе точек, чем он был связан первоначально, до своей десорбции. Естественно ( и это подтверждает эксперимент), что крупные белки того же аминокислотного состава с одной и той же колонки элюируются труднее, чем мелкие. Кстати, из наблюдения авторов следует практический вывод о том, что в случае фракционирования белков ( и НК) на оксиапатите не следует увеличивать длину колонки сверх того, что необходимо для разделения интересующих исследователя компонентов смеси макромолекул. [22]