Cтраница 2
Теперь стало очевидным, что конформация рибозы не зависит от того, является ли основание в нуклеотиде или нуклео-зиде пурином или пиримидином. Это опровергает выводы работы [11], в которой из анализа спектров ЯМР утверждалось, что во всех пуриновых нуклеозидах конформация сахара Сз - эндо, а в пиримидиновых - Сз - эндо. [16]
В настоящее время известны по крайней мере две реакции такого типа. При кислотном гидролизе 6 - э / сзо - М - изопентениладенози-на 1а в условиях, обычно применяемых для расщепления N-глико-зидных связей в пуриновых нуклеозидах ( см. гл. Детальное кинетическое исследование этого процесса 3 позволило сделать вывод, что расщепление N-гликозидной связи протекает быстрее, чем атака протона по двойной связи. [17]
Другая группа косвенных доказательств - это данные по изменению реакционной способности функциональных групп остатка сахара или фосфата в зависимости от природы гетероциклического основания. Такого рода различия отмечались часто, однако детальные кинетические исследования в этой области почти отсутствуют. Примером подобных исследований может служить работа Вит-целя 50 по кинетике гидролиза динуклеозидмонофосфатов, содержащих остаток пиримидиновых нуклеозид - З - фосфатов, по сравнению с аналогичными соединениями, содержащими остаток пуриновых нуклеозид - З - фосфатов. [18]
Так, атом N3 пуринового кольца, аминогруппа у С2 пиримидинового кольца и аминогруппа у С5 имидазольного кольца - все они могут располагаться близко к атому кислорода кольца сахара, облегчая, таким образом, перенос протона. В соответствии с этой концепцией пуриновые нуклеозиды и 5-амино - 1 - 3 - D-рибофуранозилимидазолы легко гидр о лизуются, а изоцитидин гидролизуется значительно быстрее, чем цитидин. Устойчивость природных пиримидиновых нуклеозидов может быть обусловлена малой способностью карбонильного атома кислорода у С2 к прото-низации. Незначительные различия в устойчивости гликозидной связи в родственных пуриновых нуклеозидах являются, вероятно, результатом различного расположения зарядов и наличия тауто-мерных форм протонизированных оснований. [19]
Первые пики ( основания и нуклеозиды) обычно бывают острыми н расположены очень тесно; поэтому скорость элюирования снижают так, чтобы пики были довольно большими и их можно было легко обнаружить. Кроме того, разделение этих пиков зависит от объема образца; по возможности он должен быть не более 2 мл. Сначала элюируются многие пиридиновые, пиримидшювые, пуриновые и другие основания, однако они ire отделяются четко друг от друга. Смесь оснований следует разделять на колонке с дауэксом 50; при этом следует соблюдать известные предосторожности, поскольку пуриновые нуклеозиды могут гидролизоваться до соответствующих оснований. Зато при хроматографии на колонке с дауэксом 1 осложнения невелики. Если начальная концентрация элюи-рующего буфера слишком высока, то расстояние между пиками аденози-на и 2 - АМФ сокращается, а время элюирования тимина и инозина не изменяется. При слишком высокой температуре колонки сокращается продолжительность элюирования в целом, и пики инозина, аденозина и З - АМФ не полностью отделяются от пиков, которые появляются непосредственно перед ними. При этих условиях не происходит полного отделения 2 - УМФ от З - УМФ. ЦМФ, не отделяются от 2 -, З - нуклеотидов, а 5 - ИМФ и 5 - АМФ также не разделяются полностью. Однако это почти не снижает практического значения метода. Его можно использовать для разделения б - иуклеотидов, которые получаются из РНК при нуклеазном гидролизе, и 2 -, З - нуклеотидов, которые образуются при щелочном гидролизе РНК. [20]