Cтраница 3
В течение длительного времени была известна лишь относительно небольшая группа нуклеотидкоферментов, производных аденозин-5 - пирофосфата. Позднее наши знания о биологическом значении большого числа нуклеотидных производных, известных под общим, до некоторой степени вольным названием нуклеотидкоферментов. Помимо расширения функций кофакторов биологического трансфосфорилирования и переноса электронов, эти достижения выявили роль промежуточных продуктов типа смешанных ангидридов в переносе Сахаров, карбоновых кислот, аминокислот, сульфата и нуклеотидов. Хотя некоторые из этих нуклеотидных соединений вполне могут участвовать как коферменты в сложных мультиферментных системах, где может происходить регенерация, но точнее будет относить их в основном к активным промежуточным соединениям или в случае применения очищенных ферментных препаратов - к субстратам. До сих пор неизвестна биологическая функция симметричных динуклеозид-пирофосфатов н не обнаружены природные диэфиры трифосфорной кислоты. [31]
Основные трудности в определении последовательности оснований в рибосомной, информационной и вирусной РНК возникают вследствие большого размера их молекул. Длина цепей этих молекул колеблется от 1300 звеньев у РНК вируса-сателлита вируса некроза табака, 1500 звеньев у 16 S рибосомной РНК до 6000 и более звеньев у вирусных РНК. Если это сопоставить с примерно 75 звеньями у тРНК и 120 звеньями у 5S РНК, то становится ясно, что определение нуклеотидных последовательностей у таких больших молекул по сравнению с более короткими в 1О - 20 раз более трудоемко. Составление полных и точных нуклеотидных перечней на основании гидролиза высокомолекулярных РНК специфическими нуклеазами даже при помощи наиболее эффективного в настоящее время метода перекрывающихся последовательностей является сложнейшей задачей. [32]
Фракционирование сложной смеси на колонке, заполненной целлюлозным анионообменным материалом, обнаружило присутствие двух больших серий веществ; они были идентифицированы как линейные олигодезоксинуклеотиды ( с 3 - 5 -меж-нуклеотидными связями), содержащие концевой 5 -моноэтерифици-рованный фосфатный остаток, и гомологический ряд циклических олигонуклеотидных производных, получающихся в результате фосфорилирования концевой З - гидроксильной группы 5 -фосфат-ной группой, находящейся на другом конце олигонуклеотида. Степень внутримолекулярной циклизации уменьшается с увеличением длины цепи; так, циклического пентануклеотида образуется только небольшое количество по сравнению с линейной пентатимидиловой кислотой. Члены обоих рядов вплоть до пентануклеотида были выделены в сравнительно чистом состоянии и охарактеризованы химическими и ферментативными методами. Низкие выходы оли-гонуклеотидов объясняются частично образованием неидентифицированных нуклеотидных производных; однако хроматогра-фические методы свидетельствовали о присутствии полимеров, содержащих до одиннадцати нуклеотидов. Диэстераза змеиного яда легко расщепляет линейные полимеры до тимидин-5 - фосфата, тогда как при обработке моноэстеразой предстательной железы ( для удаления концевого 5 -фосфата) и затем диэстеразой селезенки получаются тимидин-3 - фосфат и концевой тимидин. Длина цепи определялась из отношения количества общего фосфора к количеству фосфора, образующегося при обработке полимера моноэстеразой, и из относительных количеств мононуклеотида и нуклеозида, образовавшегося при гидролизе диэстеразой ( яда или селезенки) полученного олигонуклеотида, у которого предварительно был удален концевой фосфатный остаток. Однако, поскольку даже очищенная диэстераза яда может содержать пирофосфатазу [11], очень желательно безукоризненное доказательство чистоты, гомогенности и структуры высших олигонуклеотидов. [33]
В настоящее время не менее важной считается и вторая, а именно эволюционная функция иммунитета. Как мы уже говорили, эволюционные преобразования молекулярной конституции живых существ обусловлены мутациями именно тех структур, которые вступают во взаимодействие. Поэтому и формирование конституционального иммунитета того или иного организма, и сопряженное совершенствование патогенных свойств микробов обеспечивают эволюцию основных биомолекулярных компонентов - липидных, углеводных, белковых, нуклеотидных и др. Следовательно, молекулярная конституция ныне живущих организмов является историческим итогом, своего рода летописью ожесточенных сражений патогенных микробов с жертвами. [34]
Существуют различные кристаллические формы ДНК, но наибольший интерес представляет В-форма, в которой ДНК существует при высокой влажности, поскольку именно она встречается in vivo. Соли ДНК, полученной из различных источников, образуют волокна с достаточно регулярной структурой и дают характерные для спиралей дифракционные рентгеновские картины. Кристаллографический период в направлении оси волокна в В-форме равен 34 А. Сильный меридиональный рефлекс соответствует межплоскостному расстоянию 3 4 А. Анализ сильных рефлексов с учетом размеров элементарной ячейки и величины плотности приводит к заключению, что в В-форме на каждые 3 4 А приходится по два нуклеотидных остатка. [35]
Для этого следует подобрать подходящую нуклеазу. Для гидролиза РНК применяют обычные РНК-азы. РНК-аза Т2 из такадиастазы действует подобно щелочи, освобождая нуклеозид-3, 5 -дифосфат, содержащийся на левом конце молекулы. Более специфические РНК-азы - панкреатическая РНК-аза и РНК-аза TI из такадиастазы - отщепляют как концевые нуклеозиддифосфаты, так и более крупные фрагменты, содержащие фосфатные группы у 3 - и 5 -конца. Эти соединения можно отделить от остальных продуктов реакции, таюке используя различия в их зарядах; однако для этого требуется более совершенный метод, поскольку в гидролизате обычно имеются олигонуклеотиды, заряды которых меньше пли больше зарядов динуклеозиддифосфатов либо равны им. На первом этапе продукты гидролиза разделяют по величинам их суммарных отрицательных зарядов с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-сефадексе в 7 М мочевине. Если хроматографируют при рН 7 8, то концевое звено за счет того, что оно имеет две фосфомоноэфирные группировки, будет элюироваться вместе с фрагментами нуклеотидной цепи, содержащими на два нуклеотидных остатка больше, но несущими тот же суммарный отрицательный заряд. В этих условиях вторичная диссоциация фосфатных групп подавлена, и заряд концевого звена отличается на одну единицу от заряда других полимерных фрагментов. [36]