Образец - белок
Cтраница 2
В качестве удовлетворительного метода высушивания было предложено применять лиофилизацию [76]; в этом случае сводится к минимуму количество окклюдированной воды и образуется пористое вещество, из которого легко экстрагируются также липидные вещества. Высушенные белки исключительно гигроскопичны, поэтому следует с возможной тщательностью избегать поглощения ими влаги. По этой причине образцы высушенного белка, предназначаемые для использования в других анализах, обычно приводят в равновесие с влагой воздуха; поправка на влажность вводится на основании отдельного определения. [16]
После окончания полимеризации удаляют одну из герметизирующих прокладок ( см. инструкцию к прибору), вынимают из геля шаблон-гребенку и вставляют ячейку в прибор. После сборки прибора электродные камеры заполняют буферным раствором, а в лунки-колодцы на поверхности геля тонко оттянутым капилляром из стекла или из тефлоновой или полиэтиленовой трубочки наносят образцы белка. Необходимо, чтобы плотность образцов белка была выше плотности буферного раствора. Поэтому раствор белка готовят на 10 % - ном растворе сахарозы. После нанесения образца прибор подключают к источнику тока и проводят электрофорез. После того как маркерный краситель, вносимый с образцом белка, достигнет нижней границы пластины, источник питания выключают, сливают электродные буферы и вынимают гелевую ячейку. Из ячейки вынимают уплотнительные прокладки, аккуратно отделяют одно стекло от другого и переносят пластину геля в плоскую кювету или пластмассовую коробку. Для фиксации, прокраски и обесцвечивания используют те же растворы, как и в случае цилиндрических гелей. Время прокраски уменьшают в два раза. [17]
Обработка белков 6 М НС1 при 110 С в вакууме приводит к гидролизу пептидных связей, но одновременно с этим происходит разложение триптофана, гидролиз аспарагина и глутамина соответственно до аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также частичное разложение серина, треонина, цист ( е) ина. Пептидные связи между аминокислотами с объемистыми боковыми группами, такими как Не и Val, более устойчивы к гидролизу. Хорошо известно, что гидролизуя образцы белков в течение 1, 2 и 3 дней, необходимо экстраполировать количество таких аминокислот, как Ser и Thr к нулевому времени, а Не и Val - к бесконечному. В случае цист ( е) ина целесообразно перед гидролизом либо окислить его в цистеиновую кислоту, либо превратить в S-карбоксиметилци-стеин или 4-пиридилэтилцистеин ( см. разд. Обычно, в особенности если белок содержит углеводы, образуются продукты осмоления. После гидролиза соляную кислоту лучше удалить, так как она мешает при последующем разделении аминокислот. [18]
К образцу белка добавляют 1 - 2 мл надмуравьиной кислоты и оставляют в закрытом сосуде в течение часа на холоде. После этого содержимое сосуда разводят водой в 50 раз и высушивают образец лиофилизацией или на роторном испарителе. Во избежание попадания сильного окислителя в приборы образцы белка можно высушивать в специально отведенном для этих целей вакуумном эксикаторе над NaOH. В этом случае раствор белка в надмуравьиной кислоте разбавляют равным объемом воды и выпаривают. Процедуру с добавлением воды и выпариванием над NaOH повторяют 3 раза. [19]
Сбор и анализ отдельных фракций осуществляются при помощи автоматических приспособлений. Метод Мура и Стейна позволяет получить через 24 ч данные о полном аминокислотном составе образца белка, используя при этом только 2 5 - 3 5 мг белка. Для оценки эффективности и значения этого метода полезно напомнить, что старые и более грубые аналитические приемы требовали для получения данных о полном аминокислотном составе белка нескольких недель трудоемкой работы, связанной с расходованием десятков граммов белка. [20]
Снижению потерь большинства аминокислот при кислотном гидролизе способствует проведение его в стеклянных ампулах под вакуумом с большим избытком ( 200 - 5000-кратным) тщательно очищенной и перегнанной над SnCl2 соляной кислоты. Распад тирозина предупреждают добавлением в ампулу фенола. Чтобы избежать превращения серусодержащих аминокислот в продукты различной степени окисления при гидролизе и последующих процессах хроматографии и электрофореза, образцы белка, содержащие цистеин и цистин, до гидролиза обрабатывают надмуравьиной кислотой. При этом образуется стойкое производное - цистеиновая кислота. Если содержание какой-либо аминокислоты с увеличением времени гидролиза постепенно уменьшается, его находят на графике зависимости содержания этой аминокислоты от длительности гидролиза путем экстраполяции к нулевому времени гидролиза. [21]
 |
Стойка для диск-электрофореза в капиллярах. [22] |
Капилляры вводят через резиновую пробку толщиной 1 5 мм, вставленную в один конец стеклянной трубки диаметром 5 мм, содержащей электродный буфер. Другой конец капилляра помещен в стеклянный сосуд, содержащий тот же буфер. Электродами являются 0 5 мм платиновые проволочки. Таким образом, 5 образцов белка в 5 капиллярах анализируют за один опыт. Электрофорез ведут в холодильном шкафу или охлаждают капилляры вентилятором. Аппарат для микроразделения ( рис. 2) состоит из стойки для 5 установок. [23]
Имеется ряд других примеров применения результатов титрования для изучения химически измененных белков. Одно из наиболее фундаментальных исследований посвящено различным производным кристаллического сывороточного альбумина человека, полученным Хьюзом и его сотрудниками. Кривые титрования меркаптальбумина и образцов белка, кристаллизованного из деканола, лишь незначительно отличаются друг от друга в щелочной области. [24]
Однако в указанных условия полностью разрушается ДНС-триптофан, частично разрушаются дан-сильные производные метионина, карбоксиметилцистеина и пролина. С другой стороны, вследствие того, что пептидные связи, образованные остатками алифатических аминокислот ( валина, лейцина, изолейцина), обладают большой устойчивостью к кислотному гидролизу, в ходе кратковременного гидролиза они разрываются не полностью. Это может приводить к образованию дансилированных дипептидов и усложнять интерпретацию получаемых результатов. Чтобы избежать указанных трудностей, дансилирован-ный образец белка или пептида делят на две пробы, одну из которых гидролизуют в течение короткого ( 4ч), а другую - в течение продолжительного ( 10 - 16 ч) времени. ДНС-аминокислоты ( так же, как ДНС-ОН и ДНС-NH2) обладают интенсивной флуоресценцией ( максимум возбуждения около - 370 нм), что обеспечивает высокую чувствительность описываемого метода. [25]
Большое применение, в частности, получил метод Мура и Стейна, в котором исследуемый раствор пропускают через колонку, наполненную или крахмалом ( твердый полярный адсорбент), или ионообменной смолой ( сочетание адсорбции с ионным обменом), и затем связанные на колонке вещества вымывают с различной скоростью подходящими растворителями. Сбор и анализ отдельных фракций осуществляются при помощи автоматических приспособлений. Метод Мура и Стейна позволяет получить через 24 часа данные о полном аминокислотном составе образца белка, используя при этом только 2 5 - 3 5 мг белка. Для оценки эффективности и значения этого метода полезно напомнить, что старые и более грубые аналитические приемы требовали для получения данных о полном аминокислотном составе белка нескольких недель трудоемкой работы, связанной с расходованием десятков граммов белка. [26]
После окончания полимеризации удаляют одну из герметизирующих прокладок ( см. инструкцию к прибору), вынимают из геля шаблон-гребенку и вставляют ячейку в прибор. После сборки прибора электродные камеры заполняют буферным раствором, а в лунки-колодцы на поверхности геля тонко оттянутым капилляром из стекла или из тефлоновой или полиэтиленовой трубочки наносят образцы белка. Необходимо, чтобы плотность образцов белка была выше плотности буферного раствора. Поэтому раствор белка готовят на 10 % - ном растворе сахарозы. После нанесения образца прибор подключают к источнику тока и проводят электрофорез. После того как маркерный краситель, вносимый с образцом белка, достигнет нижней границы пластины, источник питания выключают, сливают электродные буферы и вынимают гелевую ячейку. Из ячейки вынимают уплотнительные прокладки, аккуратно отделяют одно стекло от другого и переносят пластину геля в плоскую кювету или пластмассовую коробку. Для фиксации, прокраски и обесцвечивания используют те же растворы, как и в случае цилиндрических гелей. Время прокраски уменьшают в два раза. [27]
 |
Схема прибора для вертикального электрофореза в пластинках полиакриламидного геля. [28] |
Для ее создания в выполненную из пластика рамку вставляют два стекла. Стекла плотно вставляют в рамку и ячейку герметизируют с помощью специальных прокладок из силиконовой резины. В зазор между стеклами заливают смесь для полимеризации ( см. с. Если разделение проводят в геле только одного типа, раствор заливают в кассету доверху и сразу же между стеклами вставляют специальную пластинку - гребенку. Зубцы ее образуют углубления на поверхности геля, в которые впоследствии вносят образцы белка. Если в работе используют два типа гелей ( концентрирующий и разделяющий), то в кассету сначала на высоту 85 - 95 мм от дна заливают раствор для полимеризации разделяющего геля. [29]
Для того чтобы получить воспроизводимые спектры флуоресценции нерастворимых белков, необходимо начинать с полностью открытой кюветы. Микрокювету 4 с диском 5 ( рис. 9.5) с помощью пастеровской пипетки наполняют гелем белок-агарозы ( максимальный объем геля 100 мкл, но обычно достаточно 50 мкл) и гель немедленно покрывают 100 мкл буфера, пригодного для элюиро-вания. Затем с помощью перистальтического насоса через гель пропускают элюирующий буфер. Используют скорости потока 0 2 - 0 5 мл / мин. Все спектры записывают после того, как гель промывают в течение 10 - 15 мин буфером. Гели белок-сефарозы 4В облучают только в течение времени, необходимого для записи спектров излучения, для того чтобы фотоинактивация геля была минимальна. Образцы геля с присоединенным белком можно использовать повторно, если работать по описанной методике, причем показано, что фотоинактивация образцов белка незначительна. [30]
Страницы: 1 2