Cтраница 2
Определение мест привязки олигосахаридных цепей в белках проводится путем подбора таких условий расщепления полипептидной цепи, которые позволили бы получить фрагменты, несущие лишь по одной углеводной цепочке. После определения последовательности аминокислот и положения углеводной цепи в глико-пептиде локализуют его положение в исходной молекуле. [16]
После фиксации рибосомы на мембране и образования канала необходимость в сигнальной последовательности исчезает и она отщепляется особым ферментом - сигнальной пепти-дазой. Поэтому при определении последовательности аминокислот в полностью синтезированной молекуле гормона не удается обнаружить в нем наличие сигнального пептида. После завершения синтеза белковой цепи рибосома освобождается и уходит в цитоплазму, канал ликвидируется, а полностью синтезированный пептид или белок оказывается вне матрикса цитоплазмы. Он поступает в аппарат Гольджи или в запасающие гранулы, а затем секретируется клеткой в среду. Блобел назвал белок, имеющий в своем составе сигнальный пептид, прегормоном. [17]
Химия предоставила методы определения последовательностей аминокислот в белковых цепях, обычно называемых полипептидными. Химики также научились собирать аминокислоты в нужном порядке и получать в лаборатории полипептиды и даже небольшие белки, идентичные выделенным из природных источников. [18]
Полипептидные цепи в молекулах белков часто бывают связаны между собой за счет дисульфидных связей цистина, которые способны образовывать мостики между разными участками одной цепи или разных цепей, разрываться и вновь образовываться, связывая другие участки цепей. Дисульфидные связи мешают определению последовательности аминокислот и поэтому их разрушают перед анализом, окисляя надмуравьиной кислотой или восстанавливая сульфгидрильными соединениями, как бы освобождая при этом сами цепи. [19]
Приведенным методом были, например, найдены следы первых 9 аминокислот в меланофорном пептиде ( Харрис и Рус [2]) из одной навески, равной 2 8 мг. Эти методики, разработанные для определения последовательности аминокислот в пептидах, нельзя, однако, применять для белков, поскольку фенилтиокарбаматы белков не растворяются в кислой среде, которая необходима для отщепления фенилтио-гидантоина. [20]
После анализа образовавшихся полипептидных цепей гемоглобина было найдено, что цистеин в них замещен на аланин. Следовательно, рибосомальная РНК в определении последовательности аминокислот в белке не участвовала. [21]
Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы - определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. [22]
Наиболее прямым способом является приготовление синтетических полинуклеотидов с известной последовательностью оснований, использование этих молекул в качестве мРНК в белковом синтезе и затем определение последовательности аминокислот в белке. [23]
Теоретически этот процесс можно проводить многократно до полного определения последовательности аминокислот. Однако многократное отщепление концевых аминокислотных остатков приводит к усиливающемуся повреждению оставшейся пептидной цепи, и обычно можно отделять максимум шесть или семь остатков. Для определения последовательности аминокислот необходим метод идентификации фенилтиогидантоинов, получаемых в результате ступенчатой деградации пептидов. Идентификация и определение фенилтиогидантоинов иногда трудно осуществимы, и следует использовать метод отщепления, примененный, например, при определении структуры рибонуклеазы. После удаления N-концевой аминокислоты в виде фенилтиогидантоина оставшийся пептид гидроли-зуют и анализируют. Последовательность аминокислот в этом пептиде определяют по аминокислотным остаткам, сохраняющимся в нем после каждого отщепления N-концевой аминокислоты. [24]
Концевой лизин дает а е-бис-динитрофенилыюе производное; лизин, расположенный в середине цепи или на С-конце, дает е-моноди-нитрофенильное производное. Фенольная группа тирозина и имино-группа гистидина также реагируют с динитрофторбензолом, но образующиеся производные расщепляются в условиях кислотного гидролиза пептидной связи. Для определения последовательности аминокислот белок подвергают частичному гидролизу и определяют строение образовавшихся ди - и трипептидов анализом концевых групп. Если в гид-ролизате охарактеризованы все возможные дипептиды, то последовательность аминокислот в белке может быть однозначно определена без дальнейшего анализа концевых групп. [25]
Примером белка установленного строения является инсулин. Инсулин [847, 848] различного происхождения имеет одинаковые кристаллическую форму, элементарный состав, точку плавления, оптическое вращение и физиологическую активность. Путем частичного гидролиза инсулина и определения последовательности аминокислот в осколках был установлен порядок расположения аминокислот. С помощью динитрофторбензола [851, 852] можно определить концевые аминокислоты со свободными аминогруппами, а именно, гликоколь и фенилаланин. [26]
В книге изложены современные химические методы, применяемые в исследованиях по биохимии белка. В сжатой форме автор дает описание различных методов и на конкретных примерах показывает возможности их успешного использования. Большое внимание уделяется описанию методов исследования состава и структуры индивидуальных белков: хроматографии на бумаге, ионообменной хроматографии аминокислот и пептидов ( на смолах), высоковольтного электрофореза на бумаге, определения последовательности аминокислот в белках и др. Описание отдельных методов сопровождается большим числом иллюстраций, изображающих используемую аппаратуру. [27]
Концевой лизин дает а. С-конце, дает е-моноди-нитрофенильное производное. Фенольная группа тирозина и имино-группа гистидина также реагируют с динитрофторбензолом, но образующиеся производные расщепляются в условиях кислотного гидролиза пептидной связи. Для определения последовательности аминокислот белок подвергают частичному гидролизу и определяют строение образовавшихся ди - и трипептидов анализом концевых групп. Если в гид-ролизате охарактеризованы все возможные дипептиды, то последовательность аминокислот в белке может быть однозначно определена без дальнейшего анализа концевых групп. [28]
Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия протеолитических ( вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин - аргинина и лизина, химотрипсин-триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах. [29]