Определение - пролин
Cтраница 2
Потребность в анализе индивидуальных аминокислот в физиологических жидкостях, гидролизатах белков и т.п. такова, что ныне серийно выпускается целый ряд анализаторов с автоматическим управлением последовательностью аналитических операций. В этой методике с помошьк коллектора фракций элюат делится на большое число фракций, каждая из которых анализируется колориметрически с нингидрином. Почти все аминокислоты определяются по поглощению излучения с длиной волны 570 нм. Для определения пролина и оксипролина используется излучение с длиной волны 440 нм. Хотя последующие исследователи внесли много усовершенствований в технику ионного обмена, методика, описанная Муром, Спекманом и Стейном [5], стала основой для большинства серийных автоматических анализаторов. Разделение и последующее определение обычных аминокислот в гидролизатах белков проводится двухколоночным способом. После завершения разделения колонка регенерируется 0 2 М гидроокисью натрия. Поскольку эта колонка элюируется полностью, повторно ее используют без регенерации. Обе колонки работают при 50 СС. Индивидуальные фракции анализируют с помощью цветной реакции с нингидрином. Более детально методика разделения аминокислот обсуждается в оригинальной статье. [16]
Смешивают 1 мл раствора, содержащего 0 02 - 0 4 мг а-аминокислоты [127], с 0 5 мл буферного раствора ( рН 5 3 - 5 4) и 0 5 мл 3 % - ного раствора нингидрина в метилцеллозольве. Нагревают 15 мин при 100СС, после чего добавляют 5 мл 50 % - ного изопропилового спирта и взбалтывают. После охлаждения до комнатной температуры измеряют оптическую плотность красного раствора при 570 нм. Таким способом определяют аланин, аспа-рагиновую кислоту, аспарагин, валин, глицин, глутамин, глутами-новую кислоту, гистидин, изолейцин, лизин, метионин, орнитин, серии, таурин, тирозин, треонин, фенилаланин, этаноламин, а также аммиак. При определении пролина и оксипролина получают раствор, оптическую плотность которого измеряют при 440 нм. [17]
 |
Список ряда работ, посвященных хроматографии аминокислот. [18] |
Однако описанный метод непригоден для определения пролина и других иминокислот. Определить пролин можно с помощью недавно предложенной [ 50а ] новой модификации этого метода. Амины и аминокислоты обрабатывают пиридоксалем, образующиеся при этом основания Шиффа при восстановлении превращаются в пиридоксиламинокислоты, флуоресценцию которых и измеряют с помощью приспособленного для этой цели анализатора аминокислот. Если для восстановления применяется бо-ротритид натрия NaBT4, то образующиеся кислоты можно определять радиометрическим методом. Пиридоксалевый метод пригоден также для определения пролина. [19]
Вытекающий с колонки поток последовательно проходит по вертикали через стадии разделения на фракции, регулирования рН, добавления нингидрина и фотометрического измерения. На каждой стадии поток раствора управляется электромагнитными клапанами. Фракции собираются в пробирки с верхним и нижним электропроводящими контактами для контроля объема. При замыкании контактов электролитом срабатывает реле, передвигающее коллектор фракций в следующую позицию. Разбавитель, регулирующий рН, и раствор нингидрина добавляются с помощью стеклянного шприца для подкожных инъекций, соединенного с капилляром. Для подъема и опускания поршня шприца используется электромагнитная катушка, в центре которой находится железный стержень, укрепленный в верхней части поршня. Развитие окраски происходит в стеклянной трубке с водяной рубашкой, температура которой регулируется кипящей водой, циркулирующей через термосифон. Окраска развивается в течение 1 мин, после чего кулачковое реле времени, приводимое в действие синхронным часовым двигателем, открывает клапан в основании трубки и раствор попадает в измерительную кювету двухлучевого фотометра ( фирмы Sigrist, модель UP2LD), в компенсирующем отделении которого содержится запаянная кювета с дистиллированной водой. Однолучевой фотометр с фильтрами в данном случае непригоден из-за сильного дрейфа нулевой линии при длительной работе. Определение пролина на фотометре с одним фильтром невозможно, если вовремя не заменять фильтр вручную. Сигнал фотометра регистрируется на стабильном одноточечном самописце с системой самоконтроля. При испытании установки на искусственных, смесях аминокислот полнота определения составляет 100 3 %; при этом сходимость измерений втрое лучше сходимости ручного метода. [20]
Страницы: 1 2