Cтраница 2
Полученный экстракт фильтруют и осаждают тремя объемами 96 % - ного спирта. Осадок отфильтровывают, промывают спиртом, высушивают в вакууме над хлористым кальцием и затем снова растворяют в 500 см3 воды. Отфильтрованный раствор сохраняется под толуолом. В то время как в твердом состоянии пероксидаза через короткое время теряет полностью свою активность ( вероятно вследствие необратимой коагуляции), раствор пероксидазы долгие годы устойчив; активность полученного раствора пероксидазы была определена следующим образом. [16]
При выпаривании досуха 20 см3 раствора пероксидазы в платиновой чашке получился остаток, составлявший после высушивания до постоянного веса при 115 - 0.041 г. Сухой остаток был осторожно сожжен в той те самой чашке. Таким образом, при диализе активирующая способность пероксидазы уменьшилась приблизительно вдвое, но содержание сухого вещества упало с 7 до 1.23 г. 700 см3 диализированного раствора пероксидазы подвергались дальнейшему диализу в течение 6 дней. На 13 - й день диализ был прерван, так как я опасался, что количество остающейся в диализаторе пероксидазы будет недостаточным для проведения опыта. Диализированный раствор пероксидазы, объем которого не изменился заметно за время второй стадии диализа, представлял собою опа-лесцирующую, легко фильтрующуюся жидкость, которая не становилась прозрачной при повторном фильтровании. Осадок, полученный при прибавлении 4.5 л 99 % - ного спирта к 670 см3 диализата, переводился через 24 часа на уплотненный фильтр, промывался абсолютным спиртом и высушивался в вакууме. [17]
Как известно, пероксидаза принадлежит к числу тех ферментов, которые легко выделить из живого организма. Достаточно взболтать с водой любую тонкоизмельченную растительную ткань для того, чтобы тотчас же получить экстракт, содержащий перокси-дазу и дающий при фильтровании прозрачную жидкость. Таким образом, если в дрожжах содержится дероксидаза, то она должна легко экстрагироваться водой одновременно с инвертазой и мальтазой из дрожжевых клеток, разрушенных при высушивании или при осаждении ацетоном. Вследствие присутствия больших количеств задерживающих веществ, образующихся при автолизе дрожжей, непосредственное доказательство присутствия пероксидазы в таких экстрактах невозможно. Ультрафильтрование является, однако, чрезвычайно подходящим способом для интенсивной очистки пероксидазы и других ферментов. Путем длительного промывания водой растворов пероксидазы в сконструированном мною4 довольно простом ультрафильтре мне удалось получить препараты, которые давали при окислении пирогаллола перекисью водорода на 1 мг фермента 98 мг пурпурогалина, в то время как пероксидаза из того же исходного продукта ( хрен), очищенная посредством многократного осаждения спиртом и растворения в воде, не давала более 4 - 5 мг пурпурогалина на 1 мг фермента. [18]
Пероксидаза из раствора осаждалась спиртом и вновь растворялась в 100 см3 воды. Таким образом, после обработки сулемой мы получали раствор, довольно богатый пероксидазой. Как бы мы ни подщелачивали раствор, какие бы условия аэрации мы ни создавали - регенерация не наступает. То же явление мы имели и при работе с пероксидазой, добытой по способу Баха и Шода из корней хрена. Раствор пероксидазы хрена сравнительно хорошо регенерируется, но если его очистить сулемой, он после кипячения теряет навсегда ферментативные свойства. [19]
Полученная пероксидаза-сырец ( 52 г) растиралась с 600 см3 воды, причем только незначительная часть ее переходила в раствор. По истечении 24 часов образовавшийся осадок отфильтровывался, промывался небольшим количеством воды; к фильтрату ( 600 см3) прибавлялся уксуснокислый натрий в порошке до прекращения появления мути. Потреблено: 21 г сухого уксуснокислого натрия. Предварительные опыты показали, что для диализа нельзя применять ни пергаментную бумагу, ни гильзы фирмы Шлейхер, так как пероксидаза довольно быстро диализирует через такого рода мембраны. Лучшие результаты получены с настоящим пергаментом, хотя и он пропускает значительные количества пероксидазы. Для приготовления диализатора на широкое горло склянки, дно которой было вырезано, натягивался большой кусок пергамента; полученный таким образом пергаментный мешок наполовину наполнялся раствором пероксидазы и погружался на одну треть в дестиллированную воду. [20]