Количественный анализ - аминокислота
Cтраница 1
Количественный анализ аминокислот может быть проведен при пропускании анализируемого раствора через колонки, заполненные ионообменными смолами; разделение аминокислот при этом происходит вследствие различий в их способности к комплексообразова-нию с высокополярными участками смолы. Раствор, вытекающий из колонки, смешивают с раствором нингидрина и интенсивность возникающего синего окрашивания измеряют с помощью фотоэлектро-колориметра. Затем строят график зависимости интенсивности от времени при постоянной скорости потока. [1]
При количественном анализе алкилсилилпроизводных протеиновых аминокислот в качестве внутренних стандартов применялись флюорен, фенантрен и декановая кислота [70], которые си-лилировались вместе с исследуемыми аминокислотами. Авторы отмечают, что указанные внутренние стандарты могут быть взаимозаменяемы, однако предпочитают применять декановую кислоту. Несмотря на это, при анализе аминокислот в рибонуклеазе, р-казеи-не и К-казеине внутренним стандартом служил фенантрен. [2]
Современные методы количественного анализа аминокислот основаны на элютивной ионообменной хроматографии с использованием колонок, заполненных сульфополистирольным катионитом в натриевой форме. Этот метод аминокислотного анализа впервые предложен сотрудниками Рокфеллеровского института в США Штейном и Муром [1], которые до этого занимались разделением аминокислот на крахмальных колонках. [3]
Для разделения и количественного анализа аминокислот и родственных соединений в белковых гидролизатах и физиологических жидкостях предназначены автоматические аминокислотные анализаторы, выпускаемые многими фирмами. [4]
Кроме детекторов, предназначенных для количественного анализа аминокислот и пептидов по реакции с нингидрином или другими реагентами, дающими цветную реакцию, были описаны также и другие детекторы. Полярографическое определение аминокислот в виде их медного комплекса основано на образовании из двух молекул аминокислоты и одного иона меди темно-синего комплекса. [5]
В настоящее время разработан ряд способов количественного анализа аминокислот. [6]
Из многочисленных детекторов, существующих в настоящее время, для количественного анализа аминокислот пригодны только детектор по теплопроводности, газовый денситометр и пламенно-ионизационный детектор. В детекторе теплопроводности для обеспечения достаточной чувствительности в качестве газа-носителя необходим гелий или водород, в газовом денситометре - азот или гелий, а в пламенно-ионизационном детекторе - высокоочищенный азот. [7]
При соблюдении рекомендуемых предосторожностей нингид-риновый реагент - наиболее чувствительный и воспроизводимый реагент для количественного анализа аминокислот и пептидов. При обычном режиме анализа буферированный нингидрино-вый реагент добавляется к жидкости, вытекающей из колонки, и затем смесь нагревается при 100 С в реакционной бане. Для того чтобы реакция доходила до конца и воспроизводилась, реагент должен содержать минимальное количество гидриндан-тина, так как он нестабилен на воздухе и плохо растворим в метилцеллозольве. Кроме того, для обеспечения оптимальных условий реагент должен быть защищен от света и тепла. Атмосфера азота в бутылях защищает реагент от окисления. [8]
Необходимо также иметь в виду, что щелочной гидролиз вызывает рацемизацию аминокислот, а именно серима, треонина и цистеина, которая весьма нежелательна при количественном анализе аминокислот микробиологическими методами. [9]
 |
Сравнение пиролитических газовых хроматограмм пролилфенилала-нина ( А и смеси пролина и фенилаланина ( Б. [10] |
Пиролитическая газовая хроматография аминокислот применялась несколькими авторами, впервые Янаком [67] и Улела [68], но трудно воспроизводимые условия пиролиза не позволяют надеяться, что этот подход окажется пригодным для количественного анализа аминокислот. [11]
Для количественного анализа аминокислот наиболее удобен все же способ, использующий образование комплексных соединений с медью. Содержание аминокислоты определяется по количеству меди в таком комплексе. [12]
К счастью, ни эти наблюдения, пи явления, наличие которых предполагали Бек и Эбри, не являются столь существенными, чтобы влиять на результаты качественного анализа методом хроматографии на бумаге. Для количественного анализа аминокислот иногда рекомендуют блокировать функциональные группы путем динптрофеиилирования или образования комплексов с медью. [13]
Воспроизводимость результатов можно повысить, если вымывать комплексы этих продуктов реакции с катионами тяжелых металлов, например с кадмием ( Монтрей и Коувин; П 84) или с медью. Боде, а также Фишер и Дерфель получают медные комплексы на бумаге и элюируют метанолом. Они дают критическую оценку количественного анализа аминокислот методом хроматографии на бумаге. Согласно нашим данным, недостатком этого метода является то, что объективная фотометрия может привести к ошибке скорое, чем визуальное определение, например, если мы имеем в центре пятна иной ( более слабый) тон окраски. [14]
Рассмотренные данные позволяют считать, что в ряде случаев газо-хроматографический анализ эфиров аминокислот может быть применен для определения производных с относительно высоким давлением паров, таких как эфиры алифатических и дикарбоновых аминокислот. Вероятно, что, видоизменив режимы хроматографирования, можно проводить анализ и некоторых других аминокислот. Однако вряд ли метод может быть пригоден для определения гетероциклических или двухосновных аминокислот вследствие указываемой рядом авторов деструкции их производных при хроматографическом разделении. Тем более очевидной является непригодность эфиров для количественного анализа аминокислот. Все это составляет одну из причин того, что в последних работах все большее предпочтение отдается эфирам N-замещенных производных, при использовании которых можно уменьшить размывание пиков, с одной стороны, и избежать полимеризации, с другой. [15]
Страницы: 1 2