Cтраница 3
Фермент является тетрамером и в тканях млекопитающих представлен тремя изоформами, среди которых наиболее распространены L-пируваткиназа, или печеночный изозим, и Л4 - пируваткиназа, иначе мышечный изозим. Общепризнанным является представление о L-пи-руваткиназе печени как об одном из ключевых ферментов гликолиза. Проблема регуляторной роли Л - пируваткиназы в контролировании гликолиза в скелетной мышце остается нерешенной. Отчасти это связано с тем, что к пируваткиназе мышечной ткани применимы не все критерии, согласно которым, по современным представлениям, фермент может выдвигаться на роль ключевого. В частности, является спорным вопрос об аллостерической природе фермента, а также о проявлении им кооперативных свойств при взаимодействии с субстратами. Возможная причина противоречий связана, по-видимому, с выраженной конформационной подвижностью Mi-изозима пируваткиназы, вследствие чего фермент утрачивает кооперативные свойства при изменении рН или ионного состава среды. [31]
Синтез ( регенерация) АТР осуществляется в основном с помощью трех процессов: фотосинтетического фосфорилирования ( разд. Два первых процесса сходны между собой в том, что АТР образуется в них при участии АТР-синтазы. Субстратное фосфорилирование может происходить при различных реакциях промежуточного метаболизма. В обмене углеводов важнейшие реакции, приводящие к регенерации АТР, катализируются фосфоглщераткиназой, пируваткиназой и аце-таткиназой. Бактерии и дрожжи, сбраживающие сахара, располагают лишь тем АТР, который образуется с помощью этих ферментов. [32]
Пируваткиназу исследовали [16], заменяя оба металла - магний и калий, которые необходимы для обеспечения каталитической активности. По этим данным было определено расстояние Мп2 - Т1, оказавшееся равным 820 пм. Это расстояние при введении субстрата - фосфоенолпировиноградной кислоты - уменьшалось до 490 пм, что указывает на индуцированные субстратом конформационные переходы. Роль обоих ионов металла в катализе пируваткиназой неясна, но понятно, что данные ЯМР могут быть весьма полезны при обсуждении различных моделей. [33]
Большая часть оксалоацетата, образующегося при карбок-силировании фосфоенолпирувата, восстанавливается в малат. Судя по всему, так обстоит дело и у моллюсков, и у гельминтов. В тканях этих организмов активность цитоплазматической малатдегидрогеназы ( МДГ), зависимой от НАД, весьма высока - обычно намного выше, чем активность фосфоенолпируват-карбоксикиназы и пируваткиназы. Равновесие малатдегидроге-назной реакции сильно сдвинуто в сторону образования малата, и поэтому есть основание думать, что высокая активность малатдегидрогеназы играет существенную роль: а) в поддержании концентрации оксалоацетата на низком уровне ( что предотвращает значительное обращение фосфоенолпируваткарбоксики-назной реакции) и б) в регенерации НАД для триозофосфатде-гидрогеназы. Возможно, это еще одна причина того, что пируваткиназа и фосфоенолпируваткарбокси-киназа не действуют одновременно. Можно заметить, что в анаэробном гликолизе у позвоночных точно такую же роль играет лактатдегидрогеназа. [34]
НАД ( НАДН) [121], они недостаточны для определения истинной каталитической роли этого металла. Результаты, полученные Милдваном и Винером [122, 141], могут быть интерпретированы в пользу образования комплексов фермент - Zn2 - субстрат [8], хотя, учитывая имеющиеся данные, такая интерпретация является довольно рискованной. Если бы Zn2 в центре связывания металла можно было заменить на парамагнитный ион металла, то можно было бы методом ЭПР измерить степень спин-спинового взаимодействия и, таким образом, определить расстояние между спиновой меткой и связанным металлом [ 72, 74а ] ( разд. Аналогичная замена Zn2 на Мп2 может непосредственно продемонстрировать наличие мостикового комплекса Е - М2 - субстрат изучением скоростей ядерной магнитной релаксации протонов субстрата ( разд. Этот метод был использован для изучения связанного Zn2 в пируваткиназе [144], и он является одним из немногих методов изучения окружения диамагнитного атома цинка. [35]
Прежде всего, как видно из кривых зависимости / См от температуры ( рис. 83 и 84), наблюдается тенденция избежать отрицательной температурной модуляции. Если охлаждение все же приводит к уменьшению фермент-субстратного сродства, то это происходит только при температурах, близких к нижнему пределу температур местообитания данного вида или еще более низких. Пируваткиназа и ацетилхолинэсте-раза существуют у нее в двух вариантах - тепловом и холо-довом, - синтезируемых преимущественно во время акклимации к теплу и к холоду соответственно. [36]
Впервые для изучения киназных реакций этот метод использовали Кон и Таунсенд [56], которые таким способом измерили константы устойчивости некоторых комплексов субстратов с марганцем. Последнее оказалось возможным благодаря тому, что амплитуда сигнала от комплекса гораздо меньше, чем от свободного металла. Было очень трудно получить сами спектры комплексов и еще труднее их интерпретировать. Однако благодаря этим измерениям были получены доказательства, позволившие Кон разделить киназы на две группы: тип I ( например, креатинкиназа) и тип II ( например, пируваткиназа) в соответствии с тем, как ион металла реагирует с ферментом - через - субстратный мостик ( Е - S - М) или непосредственно ( Е - М - S) ( см. разд. [37]
Обратимся к схеме, показанной на рис. 8.29. Кинетика процесса в целом определяется несколькими узкими местами, обозначенными на схеме цифрами. Реакция С & С быстрая и обратимая, поэтому будем считать, что концентрации этих веществ пропорциональны друг другу - устанавливается квазиравновесие. Далее, вплоть до реакции 3, протекает несколько быстрых обратимых реакций и, следовательно, концентрации промежуточных веществ пропорциональны друг другу. Обозначим одну из этих концентраций через У. Поэтому увеличение У за счет реакции 2 зависит как от X, так и от У. Скорость возрастания У равна скорости убыли X. В реакции 3, катализируемой пируваткиназой ( ПК), У убывает. [38]
Эта интеграция достигается двумя способами. Во-первых, АДФ, образующийся в результате фос-фофруктокиназной реакции, служит, конечно, субстратом для пируваткиназной реакции. Во-вторых, другой продукт фосфо-фруктокиназной реакции - фруктозодифосфат - сам действует как активатор мышечной пируваткиназы ( активация предшественником), по крайней мере у низших позвоночных. Механизм регуляторного действия фруктозодифосфата на этом участке сложен. Он включает: 1) прямую активацию ПК путем понижения ХМ ФЕП) и увеличения УШах и 2) непрямую, или кажущуюся, активацию путем снятия остаточного ингибирования, вызываемого АТФ. В результате этих воздействий активность ПК тесно согласуется с активностью фосфофруктокиназы. Также как и фосфофруктокиназа, мышечная пируваткиназа обладает значительно большим сродством к своему гликолитическому субстрату - фосфоенолпирувату ( ФЕП), чем пируваткиназы других тканей; поэтому при ограниченном количестве фос-фоенолпирувата она способна превращать его в пируват в 5 - 6 раз более эффективно, чем это происходит в других тканях. [39]