Cтраница 2
Так как разборка сопровождается увеличением отношения РНК: белок в частицах, то за ее ходом удобно следить по увеличению плавучей плотности частиц, например, методом изопикнического равновесного центрифугирования в градиенте концентрации CsCl. Отщепление этих последних белков требует уже применения более жестких воздействий, таких как комбинация высокой соли с мочевиной. [16]
Напомним, что при центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не па различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, и при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэтому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифу гированием в градиенте солей цезия, которое широко используется для разделения молекул по их плавучей плотности. [17]
Если частицы осаждаются в градиенте плотности, составленном с таким расчетом, чтобы он включал и плотность исследуемого вещества, то после установления равновесия они образуют слой, положение которого определяется их плавучей плотностью. В тщательно контролируемых условиях удается получать очень узкие слои, или полосы, и это обеспечивает эффективное разделение частиц, одинаковых по размерам и по форме, но несколько различающихся по плотности. [18]
При определении плавучей плотности ковалентно-замкнутой ДНК вируса полиомы ( так называемой ДНК I) в градиенте плотности хлористого цезия с изменяющимся значением рН ( щелочная область) наблюдается двухстадийный переход к денатурированному состоянию, характеризующемуся большей плавучей плотностью. [19]
Одноценочечные ДНК, в связи с тем что они обладают большей способностью к связыванию тяжелых ионов Cs, имеют плотность приблизительно на 0 016 г / см3 большую, чем соответствующая двухцепочечная ДНК. Поскольку при тех же условиях плавучая плотность РНК значительно выше ( - 2 0), а плотность белков - гораздо ниже, оба эти компонента могут быть полиостью отделены от ДНК. [20]
Если разбавленный раствор какого-нибудь высокомолекулярного вещества, например ДНК, поместить в такую систему, то в состоянии равновесия он образует относительно узкий слой на расстоянии, равном г0 от оси вращения. Это расстояние соответствует плотности раствора р В, численно равной плавучей плотности ДНК при данных условиях ( фиг. [21]
При седиментации каждая коллоидная частица или молекула растворенного полимера вытесняет в направлении, противоположном приложенной силе, объем растворителя, равный объему седи-ментируюшей частицы. Обратная величина р - 1 / Руд называется плавучей плотностью вещества. Она не совпадает с плотностью вещества в твердом состоянии вследствие некоторого влияния окружения на объем, приходящийся на каждую молекулу вещества, которое, естественно, различно в кристалле и в растворе. В результате возникает встречная выталкивающая сила, которую часто называют архимедовой силой. [22]
При определении соста ва ДНК каким-нибудь другим методом, например по плавучей плотности в градиенте CsCl [31], полученные результаты должны совпадать с данны ми, рассчитанными на основании кривых плавления. Несоответствие ука зывает на наличие в ДНК минорных ( необычных) оснований. Присутствие минорныл оснований в ДНК фагов В. [23]
Случайный характер процесса ренатурации был убедительно показан в опытах с молекулами ДНК меченными тяжелыми изотопами азота и водорода. Двухспиральная молекула, обе цепи которой содержат тяжелые изотопы, имеет заметно большую плавучую плотность, чем полностью немеченая ДНК. [24]
Показано, что существует хорошая корреляция между температурой плавления 27 или плавучей плотностью 28 таких комплексов и их нуклеотидным составом. [25]
Центрифугирование в градиенте плотности С8г804 было использовано для изучения поведения денатурированной ДНК В. Благодаря большой крутизне градиента плотности Св2804 его удобно использовать при центрифугировании в одной ячейке ДНК и РНК, плавучие плотности которых сильно отличаются. Крутизну градиента можно понизить, добавляя другие соли ( например, сульфат аммония; Бок, частное сообщение) или снижая скорость центрифугирования. Для фракционирования и характеристики при центрифугировании в градиенте плотности Cs2S04 различных ДНК [3-6, 85, 86], РНК [8, 42] и многих синтетических рибо - и дезоксирибопо-линуклеотидов [2, 19, 20, 26, 31-33, 36, 87] в качестве маркеров использовали полимеры, содержащие фторурацил, трифторметилурацил, хлор-урацил, бромурацил и иодурацил. [26]
Выделение ДНК из митохондрий ао я основано на тех же методах, которые используются для выделения ДНК из клеточного ядра; в этом случае, однако, предварительно выделяют соответствующие субклеточные частицы и перед разрушением обрабатывают их ДНК-азой, что позволяет удалить возможную примесь ядерной ДНК. Исследование физических свойств митохондриаль-ных ДНК, выделенных из разных источников, показывает, что во многих случаях этот вид ДНК отличается от ядерной ДНК по плавучей плотности и температуре плавления и, следовательно, имеет другой нуклеотидный состав. Митохондриальная ДНК имеет мол. [27]
При увеличении общей концентрации белка значение коэффициентов седиментации обычно падает. Если же при увеличении концентрации белка коэффициент седиментации возрастает, это указывает на то, что между компонентами системы установилось состояние динамического равновесия ( гл. Данное явление связано с изменением плавучих плотностей, влиянием вязкости и с обратными потоками, возникающими при седиментации вещества. Однако описывающие эту модель математические уравнения непригодны для описания седиментации при больших разбавлениях. Это очень интересный подход, но, к сожалению, его нельзя подробно осветить в таком кратком вводном курсе, как эта книга. [28]
При наличии соответствующего оборудования лучше определять содержание ГЦ-пар с помощью аналитического улътрацонтрифугирования в градиенте плотности CsCl, особенно если приходится работать с малыми количествами ( около 1 мкг) или с недостаточно очищенными препаратами ДНК ( см. статью Манделл, Шильдкраута и Мармура, стр. Если возможно, то рекомендуется применять два независимых метода. Когда приходится сравнивать большое число образцов, сочетание двух методов - определение плавучей плотности и построение кривых плавлений - позволяет достаточно точно установить состав препаратов. [29]
Многие прокариоты имеют внутренние мембранные системы, совершенно отличные от мезосом. Развитая сеть внутрицитоплаз-матических мембран характерна только для фототрофных прокариот, нитрифицирующих и метанокисляющих бактерий. Некоторые клетки образуют газовые вакуоли ( аэросомы), окруженные белковой мембраной и выполняющие у водных организмов роль регуляторов плавучей плотности. [30]