Плавучая плотность
Cтраница 3
С помощью аналитической ультрацентрифуги эти авторы исследовали распределение ДНК в 7 7 М растворе хлористого цезия при скорости 31410 об / мин. Через 5 ч в этих условиях устанавливается равновесное распределение концентрации и, следовательно, плотности CsCl. Если в начале центрифугирования ДНК распределена равномерно по всему объему, то через 30 ч молекулы ДНК перераспределяются, концентрируясь в той зоне градиента, плотность которой равна плавучей плотности соответствующей фракции ДНК в растворе CsCl. [31]
После тепловой или щелочной денатурации ДНК с последующдш быстрым охлаждением или нейтрализацией плавучая плотность ДНК увеличивается, причем у ДНК с низким содержанием ГЦ-пар это увеличение выражено более резко. В градиенте CsCl плотность увеличивается больше, чем в градиенте С8г804 ( фиг. Если формальдегид в 1 % - ной концентрации вводят во время денатурации ( после чего раствор разбавляют или диализуют), то плотность ДНК возрастает; если же его добавляют к раствору Cs2S04 при центрифугировании, то плавучая плотность одноцепочечной ДНК [3] и РНК [7] уменьшается. [32]
Повторяющиеся последовательности и сателлитная ДНК - одна из закономерностей в чередовании нуклеотидов у большинства ДНК эукариотических клеток. Эти ДНК состоят из уникальных и частично повторяющихся последовательностей. Например, в ДНК мыши повторяющиеся последовательности составляют десятую долю всего генома и представлены приблизительно одним миллионом копий последовательности, содержащей около 30 пар нуклеотидов с более низким ( Г Ц) - содержанием по сравнению с остальной массой ДНК. Имея другую плавучую плотность, ДНК с повторяющимися последовательностями при центрифугировании в градиенте плотности CsCl образует отчетливую сателлитнук полосу. Каждая из двух цепей этой ДНК настолько отличается по составу оснований, что они хорошо разделяются в растворе CsCI. Такие наблюдения основаны на исследованиях реассоциации двух цепей сателлитной ДНК, расчлененных ранее путем термической обработки. Реассоциация сателлитной ДНК осуществляется настолько быстро, что, по-видимому, в ней существует короткая последовательность, повторяющаяся много раз. [33]
Положение точки С ( расстояние G) может быть найдено также посредством итерации. Определение Q и а следует повторить несколько раз. В каждой ячейке желательно получить несколько полос ДНК; в таком случае значения аир усредняются. Наиболее достоверное значение плавучей плотности получают в том случае, когда положение полосы ДНК совпадает с истинной изоконцентрациошгой точкой С ( фиг. [34]
В этом положении она не может ни всплыть, ни осесть, поскольку плотность раствора CsCl здесь равна ее плотности. С помощью этого метода, более подробно описанного в гл. ДНК, различающиеся по содержанию 6зС - пар, поскольку они обладают разной плавучей плотностью. [36]
Обычно ее положение не совпадает с положением основной массы ДНК. Поскольку количество РНК в гибриде не настолько велико, чтобы заметно влиять на плавучую плотность гибрида, смещение полосы происходит за счет того, что РНК выбирает определенные молекулы ДНК с плотностью, отличной от плотности основной массы ДНК. [37]
Равновесное центрифугирование в градиенте плотности, впервые предложенное Мегельсопом и др. [1], является одним из наиболее ценных методов фракционирования и характеристики ДНК. Для этого обычно используют две соли цезия - CsCl и CssSCU. Градиенты плотности растворов этих солей несколько отличаются по своим свойствам. Однако содержание гуанина и цитозина ( Г Ц) в ДНК удобнее определять с помощью градиента плотности CsCl, поскольку в этом случае плавучая плотность ДНК практически линейно зависит от процентного содержания в ней ГЦ-нар ( в пределах 20 - 80 %, см. фиг. Тем не менее содержание Г Ц в неизвестном препарате ДНК иногда бывает полезно определить в градиентах плотности обеих солей. Если при этом результаты расходятся ( фиг. ДНК имеются минорные основания. [38]
Напомним, что при центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не па различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, и при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэтому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифу гированием в градиенте солей цезия, которое широко используется для разделения молекул по их плавучей плотности. [39]
В градиентах плотности CS2S04 в отличие от CsCl зависимость между содержанием ГЦ-пар ДНК и ее плавучей плотностью нелинейна; кроме того, эта зависимость выражена менее четко ( см. фиг. Однако применение Cs2S04 наряду с CsCl может оказаться полезным, так как расхождение результатов, полученных в этих двух случаях, означает, что либо ДНК содержит минорные основания, либо в ее структуре имеются какие-то аномалии. В табл. 6 приведены значения плавучих плотностей синтетических полинуклеотидов. [40]
Существует несколько физических методов абсолютного измерения молекулярных масс, в первую очередь основанных на использовании седиментации или рэлеевского рассеяния света. Они требуют существенно большего количества индивидуального биополимера, чем описанные химические и биохимические методы, проводятся путем прецизионных измерений на дорогостоящем оборудовании и применительно к задаче измерения молекулярных масс белков и нуклеиновых кислот постепенно утрачивают свое значение. Во втором случае нужно достичь состояния седиментационного равновесия и измерить распределение концентрации исследуемого биополимера вдоль центрифужной ячейки, т.е. концентрацию биополимера на нескольких разных расстояниях г от оси ротора. Оба метода требуют определения парциального удельного объема, или, что то же самое, плавучей плотности биополимера в условиях, Используемых для седиментации. [41]
Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония 14NH4 и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. [42]
Парк и др. [251-253] определили молекулярный состав квантосом, исследуя разрушенные хлоропласта шпината. Для зеленых ламеллярных структур диаметром от 2000 до 80 нм, полученных центрифугированием при постепенно возрастающих скоростях, отношение хлорофилла к азоту было довольно постоянным. Крупные структуры были, по-видимому, лишены гран, тогда как фракция более мелких частиц содержала граны. Эти результаты служат доказательством равномерного распределения хлорофилла по всей ламеллярной структуре хлоропласта. Было высказано предположение, что обычно наблюдаемая флуоресценция одних только гран объясняется более высоким содержанием ламеллярных структур. В квантосомах были обнаружены небольшие количества трех переходных металлов - железа, марганца и меди, причем концентрация марганца оказалась наиболее низкой. Марганец необходим для выделения кислорода при фотосинтезе. Позже [251] расчеты были проведены с учетом данных об объеме квантосом ( полученных путем измерений на электронных микрофотографиях), а также результатов определений эффективной плавучей плотности разрушенных ламеллярных структур в ультрацентрифуге. Было обнаружено, что молекулярный вес квантосом равен 2 - Ю6, что соответствует двум атомам марганца. Мембрана толщиной 10 нм содержит 50 % липида и 50 % белка. Следовательно, с учетом разницы в плотности ( 1 0: 1 4) можно считать, что на долю липида приходится около 6 5 нм толщины мембраны, а это согласуется с представлением о существовании двойного липидного слоя. [43]
Страницы: 1 2 3