Cтраница 3
При фотометрическом определении содержания спиртов в пробе предварительно готовят стандартную хроматографическую шкалу: подвергают хроматографическому разделению стандартные растворы, соответствующие 1; 4; 8; 12; 16; 20 мкг каждого спирта. После проявления хроматограмм вырезают каждое пятно, измельчают, помещают в пробирку и заливают 5 мл метилового или этилового спирта. Содержимое пробирки слегка встряхивают. Через 5 мин окрашенный элюат переносят в кювету и измеряют величину его оптической плотности при длине волны 445 нм. Опыты повторяют 4 - 5 раз и по полученным средним данным строят калибровочные графики зависимости оптической плотности элюатов от концентрации вещества для каждого спирта. [31]
В качестве свидетелей используют свободный ДНФ, а также мо-но - и ди - ДНФ-производные лизина. Эти соединения окрашены в желтый цвет и определение их локализации на хроматограмме не требует специальной обработки. Для обнаружения свободного лизина хрома-тограммы обрабатывают нингидрином ( с. В указанных условиях хроматографирования свободный лизин располагается вблизи линии старта, далее в порядке удаления от нее следуют: моно - ДНФ-про-изводное лизина ( е - МН2 - ДНФ-лизин), имеющее после обработки нингидрином буро-коричневое окрашивание, свободный ДНФ и ди - ДНФ-производное лизина. Для количественного определения моно - и ди - ДНФ-производных лизина соответствующие участки хроматограммы вырезают, элюируют 1 % - ным раствором NaHC03 и измеряют оптическую плотность элюатов при 360 нм. [32]
Хроматография на бумаге с использованием какой-нибудь одной системы растворителей обычно не дает возможности осуществить полное разделение всех аминокислот. Значительно большей разрешающей способностью обладает метод двумерной хроматографии. При этом после хроматографирования в одном направлении с использованием одной системы растворителей хроматограмму поворачивают на 90 и продолжают разделение с помощью второй системы растворителей. Типичная двумерная хро-матограмма гидролизата белка приведена на фиг. Индивидуальные аминокислоты проявляются нингидрином п виде пятен сине-фиолетового цвета. Пятна можно вырезать, элюировать и определить оптическую плотность элюатов, которая пропорциональна количеству соответствующей аминокислоты. [33]
После того как подвижная фаза продвинется по пластинке на 12 см, пластинку вынимают из камеры и оставляют на воздухе до полного испарения подвижной фазы. Все операции осуществляют только в вытяжном шкафу... Высушенную хроматограмму проявляют в УФ-свете на хроматоскопе. Простым карандашом или иголкой очерчивают зоны пятен узгена на пластинке. Затем силикагель из очерченных зон осторожно снимают скальпелем и количественно переносят в колбу с притертой пробкой вместимостью 20 мл. Силикагель в колбах заливают 10 мл метанола и встряхивают содержимое колб 1 ч на приборе для встряхивания. Аналогичным образом элюируют зону чистого силикагеля ( контроль) Измеряют оптическую плотность прозрачных элюатов стандартных образцов и контроля при длине волны 243 нм. Хроматографирование стандартных растворов повторяют не менее трех раз и по полученным средним показаниям строят график зависимости оптической плотности от содержания узгена. [34]