Полибуфер
Cтраница 2
Новый метод разделения белков в соответствии со значениями их изоэлектрических точек ( р /) называется хроматофо-кусированием. Белок наносят на колонку с ионообменником на основе агарозы и элюируют буферным раствором сложного состава ( полибуфером), рН которого меньше р / белка. [16]
Из проведенного рассмотрения следует, что по мере закисления обменника будет увеличиваться плотность расположения в нем положительно заряженных групп. Это не должно сильно сказываться на характере процесса, поскольку одновременно будет осуществляться блокирование этих групп анионами из полибуфера. Они даже будут в какой-то мере способствовать десорбции белка, вытесняя его из связей с ионами обменника. [17]
Максимальная ширина градиента, перекрываемого каждым из иолнбуферов, составляет 3 ед. Можно задать более узкий градиент, выбрав соответственно значения рН, при котором уравновешивать обменник и до которого титровать полибуфер. [18]
Молярность полибуфера нельзя охарактеризовать одной цифрой, поскольку он представляет собой сложную смесь веществ. Указывается среднее приращение концентрации, приходящееся на 1 ед. Разбавление полибуфера определяет объем элюцпп. При вытекании примерно первых двух объемов колонки элгоент на ее выходе будет сохранять исходное значение рН, хотя состав буфера после выхода свободного объема колонки и начнет меняться. [19]
На рис. 130, заимствованном из рекламной брошюры фирмы Pharmacia Chromatofocusing with Polybuffer and РВЕ, изменение рН на выходе колонки показано пунктиром. Рисунок иллюстрирует характер фракционирования белков яичного белка. Элюцию вели полибуфером 74, титрованным НС1 до рН 4 и разбавленным, как указано выше. [21]
Регистрацию выхода белков можно вести по УФ-поглощению при 280 нм, но не по поглощению пептидной связи ( 210 - 230 нм), так как в этой области сам полибуфер сильно поглощает свет. Полибуфер не мешает окраске белка красителями типа СВВ. Определение белка по методу Лоури в присутствии полибуфера проводить нельзя, так как он связывает ионы меди. [22]
Здесь выбор определяется в первую очередь стабильностью и растворимостью белков препарата. Колонку РВЕ 94 уравновешивали 0 025 буфером имидазол - HCl ( рН 7 4) и в нем же растворяли препарат. Авторы отмечают, что в отличие от рекомендаций фирмы элюцию с использованием полибуфера 74 ( рН 4) следует начинать не сразу, а после промывки колонки с сорбированным на ней белком тремя объемами исходного буфера. Это улучшает линейность градиента рН при элюции. [24]
Рассматриваемый белок снова десорбируется и переместится еще ниже, где опять сорбируется. Так начинается миграция зоны первого из белков вниз по колонке. Она будет заведомо меньше, чем скорость элюции, и тем меньше, чем менее концентрированный полибуфер используется для элюции. [25]
Страницы: 1 2