Полидезоксирибонуклеотида
Cтраница 2
 |
Затравочная активность ДНК при различных воздействиях. [16] |
Однако они с готовностью используют одноцепочечную ДНК фага Х174 или полидезоксирибонуклео-тид, образованный из нативной ДНК после максимального разрыва водородных связей. Для этой цели нативную ДНК обрабатывают щелочью или кислотой или же нагревают и затем быстро охлаждают, чтобы свести до минимума рекомбинацию разделенных цепей. Обработка ультразвуком сама по себе не дает нужного эффекта, так как вызывает преимущественно разрыв двойной цепи, а не отделение цепей друг от друга. Все это свидетельствует, по-видимому, о том, что основным свойством затравки является наличие одинарной цепи полидезоксирибонуклеотида, которая и выполняет роль матрицы при репликации. [17]
Единственным исключением служат РНК-синте-тазы, которые значительно более эффективно используют в качестве матрицы РНК соответствующих фагов. Для терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы затравкой могут служить как полидезоксинуклеотиды, так и олигодезоксинуклеотиды, начиная с тринуклеозиддифосфата. Эффективными затравками реакции, катализируемой полинуклеотидфосфорилазой, являются низкомолекулярные олигорибонуклеотиды, в том числе динуклеозидмонофос-фаты. В реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, в качестве матрицы могут выступать полидезоксинуклеотиды и некоторые по-лирибонуклеотиды. Однако полимеризация происходит и в присутствии коротких олигодезоксинуклеотидов. Очень медленная полимеризация наблюдается уже с тринуклеозиддифосфатами, заметно больше скорость реакции с гепта - декадезоксинуклеотидами. РНК-полимеразы из микроорганизмов могут использовать в качестве матрицы одно - и двухцепочечные полидезоксирибонуклеотиды и полирибонуклеотиды, а также олигодезоксирибонуклеотиды со степенью полимеризации 5 и выше и олигорибонуклеотиды приблизительно такого же размера. [18]
Джонс и Уильямсон ( Jones, Williamson, I960) предложили проводить деградацию полидезоксирибс - нуклеотидов реакцией / 3 -элиминирования, катализируемой основаниями, подобно тому как это происходит в случае РНК. Предполагалось, что концевой 5 -гидроксил должен быть превращен в карбонильную группу, инициирующую реакцию элиминирования. Это превращение должно протекать в условиях, не затрагивающих остальную часть молекулы нуклеиновой кислоты. Методы проведения этих реакций, разработанные Вижольи и Тенером ( Vizsolyi, Tenet, 1962), схематически представлены на рис. 6.3. На первой стадии 5 -концевой дезоксирибозный остаток молекулы ДНК действием перекиси водорода в присутствии инактивированного платинового катализатора окисляется в соответствующую уроновую кислоту. Благодаря использованию инактивированного катализатора удается избежать необратимой адсорбции ДНК, тогда как высокая реакционная способность перекиси водорода позволяет завершить окисление достаточно быстро. Далее уроновую кислоту превращают в пропиламид действием дициклогексилкарбодиимида и пропиламина, после чего проводят деградацию при помощи 0 25 H. NaOH В результате такой последовательности реакций образуется смесь, содержащая концевое основание, N - пропилфурамид и остальную часть полидезоксирибонуклеотидной цепи. Когда в качестве исходного соединения был взят тимидилил - ( 3 5) - тимидин, то в смеси продуктов деградации был обнаружен еще один, четвертый компонент, предположительно являющийся ангидротимидинуроновой кислотой. Чтобы перейти ко второму циклу деградации, полидезоксирибонуклеотид дефос-форилируют при помощи фосфатазы. [19]
Страницы: 1 2