Cтраница 1
Стартовый буфер, используемый обычно для хроматографии на DEAE-целлюлозе, представляет собой 0 01 М трис ( рН 7 5 - 8) в 7М мочевине. Различие в стартовых буферах и крутизна градиента связаны с тем, что ионообменная емкость DEА Е - целлюлозы обычно составляет V, емкости DEAE-сефадекса. [1]
Каждую колонку промывают стартовым буфером, содержащим 0 01 М фосфат калия ( рН 7 5) и О 01М меркаптоэтанол. Фракцию 4 диали - зуют против стартового буфера в течение 5 ч, затем в пять раз разбавляют тем же буфером. [2]
Колонку уравновешивают пятью объемами стартового буфера ( 0 1 М пиридинацетатный буфер рН 3 5) при температуре 50 С, которая поддерживается в ходе всего анализа. Такой градиент получают, помещая по 259 г стартового буфера ( 0 1 М, рН 3 5) и конечного буфера ( 2 0 М, рН 5 0) в два сообщающихся у дна сосуда-смесителя с одинаковым внутренним диаметром. Отводящую линию из первого сосуда смесителя соединяют через кран с насосом. Рекомендуется использовать трехходовой кран, для того чтобы в систему можно было включить третий буфер. [3]
Суспензию DEAE-иеллюлозы наливают в колонку, наполовину заполненную стартовым буфером. После того как заполнение колонки достигнет желаемой высоты, колонку промывают по крайней мере тремя объемами стартового буфера. [4]
Смесь олигонуклеотидов, обычно растворенную в 7 М мочевине или стартовом буфере, наносят на колонку, дважды обмывают небольшим количеством того же раствора и начинают элюирование. [5]
Первый сосуд-смеситель должен быть снабжен устройством ( магнитной мешалкой) для перемешивания стартового буфера по мере добавления к нему конечного буфера. [6]
Затем DEAE - целлюлозу промывают 7 М мочевиной, избыток жидкости удаляют фильтрованием и полученную лепешку суспендируют в стартовом буфере. [7]
Фракцию 5 разбавляют 4 объемами 0 О1М меркаптоэта-нола и наносят на колонку с DEAE-целлюлозой размером 1x10 см. Колонку промывают 5 мл стартового буфера и затем фермент элюируют раствором, содержащим 0 05 М фосфат ( рН 7 5) и О 01м меркаптоэтанол. Фракции, содержащие полинуклеотидкиназную активность, объединяют, разбавляют 0 01 М меркаптоэтанолом, как описано выше, и рехроматографируют на колонке с DEAE-целлюлозой размером 1 х 5 см. Фракции из последней рехроматографии, содержащие полинуклеотидкиназу, объединяют. [8]
Стартовый буфер, используемый обычно для хроматографии на DEAE-целлюлозе, представляет собой 0 01 М трис ( рН 7 5 - 8) в 7М мочевине. Различие в стартовых буферах и крутизна градиента связаны с тем, что ионообменная емкость DEА Е - целлюлозы обычно составляет V, емкости DEAE-сефадекса. [9]
Позднее Миллер [83] описал ускоренный одноколоночный метод анализа, устраняющий такое изменение фоновой линии. Для этого в стартовый буфер добавляют цистеиновую кислоту ( 8 3 мкмоль / л), не анализируемую по этому методу, которая повышает фоновую линию в начале анализа до уровня, равного высоте фоновой линии в конце анализа. Высокие чувствительность и разделяющая способность были достигнуты благодаря тщательному изучению характеристик ионообменной смолы, конструкции колонки, кюветы и характеристик регистрирующего потенциометра. [10]
Каждую колонку промывают стартовым буфером, содержащим 0 01 М фосфат калия ( рН 7 5) и О 01М меркаптоэтанол. Фракцию 4 диали - зуют против стартового буфера в течение 5 ч, затем в пять раз разбавляют тем же буфером. [11]
Колонку уравновешивают пятью объемами стартового буфера ( 0 1 М пиридинацетатный буфер рН 3 5) при температуре 50 С, которая поддерживается в ходе всего анализа. Такой градиент получают, помещая по 259 г стартового буфера ( 0 1 М, рН 3 5) и конечного буфера ( 2 0 М, рН 5 0) в два сообщающихся у дна сосуда-смесителя с одинаковым внутренним диаметром. Отводящую линию из первого сосуда смесителя соединяют через кран с насосом. Рекомендуется использовать трехходовой кран, для того чтобы в систему можно было включить третий буфер. [12]
Суспензию DEAE-иеллюлозы наливают в колонку, наполовину заполненную стартовым буфером. После того как заполнение колонки достигнет желаемой высоты, колонку промывают по крайней мере тремя объемами стартового буфера. [13]
Вначале смолу переводят из натриевой формы в литиевую. Для этого смолу помещают на воронку Бюхнера и промывают десятью объемами 2 % - ной гидроокиси лития, затем десятью объемами деионизированной воды и окончательно десятью объемами стартового буфера. После этого смолу оставляют на ночь в стартовом литийцитратном буфере, чтобы полностью перевести ее в литиевую форму. [14]
Колонку заполняют смолой так, как описано в разд. Но предварительно смолу промывают на воронке Бюхнера 4 % - ным едким натром, затем деионизированной водой, 2 М уксусной кислотой, деионизированной водой, 2 М пиридином, затем снова деионизированной водой и окончательно стартовым буфером. На объем смолы требуется примерно около десяти объемов каждого из реагентов. [15]