Электродный буфер

Cтраница 2

Простое ycipoitcTBO для десорбции вещества с аффинного сорбента методом электрофореза [ Morgan et al., 1979 ]. [16]

Прибор для электрофореза состоит из двух камер ( рис. 8), которые устанавливают одну под другой. В верхней камере укрепляют трубочки с гелем, нижние концы которых опущены в нижнюю камеру. В верхнюю и нижнюю камеры прибора наливают электродный буфер с рН 8 3 так, чтобы концы трубочек погружались в буфер верхней и нижней камер. [19]

На рис. 135 показана схема простого устройства, предложенного для этой цели Морганом и соавторами. Сорбент с сорбированным на нем веществом они вносили тонким слоем на мембрану из пористого полипропилена, отделяющую его от камеры элюции, которая, в свою очередь, диализной мембраной была отделена от нижнего электродного буфера. Верхний электродный буфер, которым уравновешивали и сорбент, выбирали таким образом, чтобы десорбированный белок был должным образом заряжен. Работа этой системы не требует особых пояснений. Главное ее достоинство - малый объем, куда элюируется вещество с колонки. Разумеется, примеси необходимо десорбировать и смыть с колонки до ее установки в камеру элюции. [20]

РНК) также включают стадик получения наборов одноцепочечных фрагментов, различающихся по длине на один нуклеотидный остаток. Получают четыре серии фрагментов, каждый из которых оканчивается определенным нуклеотидом. В обоих случаях реакцию проводят в таких условиях, чтобы в среднем степень модификации составляла один остаток на одну полинуклеотидную цепь. Чтобы исключить возможность образования внутримолекулярных вторичных структур ( этот процесс особенно характерен для длинных олигонуклеотидов), в электродный буфер и в гель добавляют мочевину, выполняющую роль денатурирующего агента. При разработке этих систем гель-электрофореза было отмечено, что длина нуклеотидной последовательности, поддающейся прочтению непосредственно с помощью электрофореграммы, определяется разрешающей способностью метода электрофореза, которая в свою очередь зависит от толщины геля. В случае гелей толщиной 1 - 2 мм на радиоавтограмме обнаруживаются диффузные полосы, поскольку радиоактивный источник ( фрагменты ДНК) весьма удален от поверхности рентгеновской пленки. [21]

Прибор для электрофореза состоит из двух камер, которые устанавливают одна над другой. В верхней камере укрепляются трубочки с гелем. Нижние концы трубочек должны быть опущены в нижнюю камеру. Втулки с них снимают. Нижние концы трубочек смачивают из шприца электродным буфером. Наливают в нижнюю камеру буфер так, чтобы трубочки были погружены в него на 1 - 2 см. Следят, чтобы у входа в каждую трубочку не было пузырей воздуха. Верхний конец трубочек доливают электродным буфером до конца трубочки так, чтобы образовался выпуклый мениск. В верхнюю камеру наливают электродный буфер до погружения трубочек. [22]

После окончания полимеризации удаляют одну из герметизирующих прокладок ( см. инструкцию к прибору), вынимают из геля шаблон-гребенку и вставляют ячейку в прибор. После сборки прибора электродные камеры заполняют буферным раствором, а в лунки-колодцы на поверхности геля тонко оттянутым капилляром из стекла или из тефлоновой или полиэтиленовой трубочки наносят образцы белка. Необходимо, чтобы плотность образцов белка была выше плотности буферного раствора. Поэтому раствор белка готовят на 10 % - ном растворе сахарозы. После нанесения образца прибор подключают к источнику тока и проводят электрофорез. После того как маркерный краситель, вносимый с образцом белка, достигнет нижней границы пластины, источник питания выключают, сливают электродные буферы и вынимают гелевую ячейку. Из ячейки вынимают уплотнительные прокладки, аккуратно отделяют одно стекло от другого и переносят пластину геля в плоскую кювету или пластмассовую коробку. Для фиксации, прокраски и обесцвечивания используют те же растворы, как и в случае цилиндрических гелей. Время прокраски уменьшают в два раза. [23]

Смесь для полимеризации следует готовить в количестве, необходимом для опыта. Если используют, например, 12 трубочек, нужно приготовить 30 мл смеси. Осторожным вращением колбочки раствор перемешивают и вносят пипеткой в трубочки, укрепленные в подставке, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь полимеризуемого геля. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 1 - 1 5 см от верхнего края трубочки. Сверху осторожно наслаивают воду ( 0 2 - 0 3 мл) для образования ровной поверхности геля. Полимеризация обычно заканчивается через 20 - 40 мин, что определяют по образованию хорошо видимой границы между гелем и водой. По окончании полимеризации наслоенную воду удаляют фильтровальной бумагой. Верхний резервуар присоединяют к нижнему, предварительно заполненному электродным буферным раствором. Следят за тем, чтобы на концах трубочек не было пузырьков воздуха. Количество наносимого белка зависит от его гомогенности: для индивидуального белка - 25 - 50 мкг, для гетерогенных смесей это количество может быть увеличено до 50 - 250 мкг. Это необходимо для предотвращения смешивания белка с электродным буфером. Высокая ионная сила исследуемых образцов мешает четкому разделению белков, поэтому такие растворы следует предварительно обессолить. [26]

Страницы: 1 2