Cтраница 2
Растворенный в мономерной форме ДДС-Na легко отделяется от белка на сефадексе G-25. С другой стороны, как уже упоминалось, связанные с белком детергенты могут очень существенно увеличить размеры и молекулярную массу комплекса, что следует иметь в виду при выборе пористости геля. [16]
Общий объем Vt равен объему колонки. Внешний объем Увв можно определить, если хроматографировать на колонке, заполненной гелем, какое-либо высокомолекулярное вещество, не способное проникать в поры геля: объем растворителя, прошедшего через слой геля до проскока хроматографируемого вещества, соответствует внешнему объему. Внутренний объем Упор связан с пористостью геля. Упор определяется сравнительно просто. Для этого следует знать величину ST, называемую емкостью геля по растворителю и равную количеству растворителя в граммах, поглощенного при набухании 1 г сухого геля. Для определения емкости по растворителю навеску сухого геля оставляют набухать в выбранном растворителе, затем последний удаляют осторожным продолжительным центрифугированием, после чего набухший гель взвешивают. [17]
Поэтому давление водяного пара и подвижность адсорбированной воды отличаются от соответствующих свойств свободной воды. Количество обратимой воды указывает непосредственно на пористость геля. [18]
Гели, используемые для заполнения колонок в ЭХ, должны отвечать определенным требованиям, среди которых основными являются устойчивость к воздействию растворителей, температуры, механическая устойчивость в рабочем состоянии, отсутствие адсорбционных свойств по отношению к разделяемым образцам. Они представляют собой полимеры стирола, поперечно сшитые дивинилбензолом. Степень сшивания определяет жесткость, набухаемость и пористость гелей. Кроме полисти-рольных можно применять винилацетатные ( меркогели), декстрановые ( сефадексы) гели. Наряду с органическими гелями в ЭХ используют и неорганические носители: силикагели, пористые стекла. [19]
Заполнение колонок - Гели, используемые для заполнения колонок в ЭХ, должны отвечать определенным требованиям, среди которых основными являются устойчивость к воздействию растворителей, температуры, механическая устойчивость в рабочем состоянии, отсутствие адсорбционных свойств по отношению к разделяемым образцам. Они представляют собой полимеры стирола, поперечно сшитые дивинилбензолом. Степень сшивания определяет жесткость, набухаемость и пористость гелей. Кроме полисти-рольных можно применять винилацетатные ( меркогели), декстрановые ( сефадексы) гели. Наряду с органическими гелями в ЭХ используют и неорганические носители: силикагели, пористые стекла. [20]
Надо отметить, что механизм гелевой хроматографии представляет собой ряд сложных явлений, часть которых недостаточно исследована и находится в процессе изучения. Недавно выяснилось, что вопреки первоначальным наблюдениям удерживаемые объемы макромолекул зависят не только от их размеров и пористости геля, но и от скорости элюирования, температуры колонок и величины образца Результаты этих исследований пока не учитываются ни в одной из теоретических работ по гелевой хроматографии, которые используют распределение пор в геле или различия в коэффициентах диффузии макромолекул. Очевидно, только сочетание этих подходов с учетом зависимости скорости диффузии макромолекул от пористости геля позволит выяснить физическую картину, лежащую в основе процесса гелевой хроматографии, а это в свою очередь дает возможность превратить гелевую хроматографию в абсолютный метод, не требующий калибровки. Тем не менее необходимо отметить полезность работ феноменологического характера, которые позволяют производить коррекцию гелевых хроматограмм с учетом диффузионных факторов размывания и использовать для этих целей вычислительную технику. [21]
Если компоненты смеси незначительно различаются по молекулярному весу, их объемы выхода с колонки также очень близки. Поскольку рабочий объем колонки составляет определенную долю общего объема геля ( см. стр. ПО, 111), то совершенно очевидно, что при прочих равных условиях разделение будет тем лучше, чем длиннее колонка. Конечно, пористость геля должна быть оптимальной для данного случая. Желательно использовать такой гель, чтобы в его гранулы совсем не мог проникать только один из компонентов исследуемой смеси. Если компоненты сильно различаются по молекулярному весу, то целесообразно проводить предварительное фракционирование на геле средней пористости. Затем низкомолекулярную и высокомолекулярную фракции можно хроматографировать повторно на соответствующих гелях. [22]
Возможность разбиения НК на небольшое число классов или групп, резко отличающихся друг от друга по размерам, позволяет осуществлять их сортировку и фракционирование методом гель-фильтрации. В первую очередь это относится к разделению ДНК и РНК. Еще в 1975 г. Луркин и соавторы использовали гель-фильтрацию для очистки ДНК растительного происхождения от РНК и пигментов. Воспользуемся случаем напомнить, что концентрация соли играет особую роль в осуществлении гель-фильтрации НК, определяя их конформацию и упаковку, которая при увеличении концентрации соли становится более компактной. Напомним также, что даже в присутствии соли макромолекулы НК упакованы более рыхло, чем белки, и это надо учитывать при выборе пористости геля. [23]